蕲艾提取液对肝纤维化大鼠细胞外基质及肝星状细胞的影响

【摘要】： [研究背景]肝纤维化(HF)是慢性肝病的共同病理学基础,是形成肝硬化的必经病理阶段,其实质在于细胞外基质(ECM)的过度沉积。肝星状细胞(HSC)的激活增殖是引起肝纤维化形成的中心环节,阻抑激活的HSC活化、增殖及促进HSC凋亡是治疗肝纤维化的重要途径。TGFβ1-Smad信号转导途径在肝纤维化的发生发展中起重要的作用。临床研究发现湖北省的道地药材—蕲艾有明显的抗肝纤维化的作用,为进一步研究该药的抗肝纤维化作用机制,本研究拟对蕲艾提取液对肝纤维化大鼠细胞外基质及肝星状细胞的影响进行探讨。 [目的]本实验以异种血清诱导的免疫性肝纤维化大鼠模型为研究对象,观察道地中药材制剂蕲艾提取液对肝纤维化大鼠细胞外基质的影响；通过研究蕲艾提取液药物血清对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖、凋亡及对TGFβ1-Smad信号转导途径的影响,从分子生物学水平阐明蕲艾提取液抗纤维化作用的机制。 [方法] (一)蕲艾提取液对肝纤维化大鼠细胞外基质的影响：Wistar大鼠60只随机分为正常对照组、模型组和高、中、小剂量蕲艾提取液治疗组,采用异种血清腹腔内注射构建肝纤维化大鼠模型,HE染色后,光镜下观察大鼠肝组织纤维化程度；SABC型免疫组化染色法观察肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原及基质金属蛋白酶抑制因子-1 (TIMP-1)含量变化,并对免疫组化检测结果进行图像分析。 (二)蕲艾提取液对大鼠肝星状细胞的影响： 1.蕲艾提取液药物血清对大鼠肝星状细胞增殖的影响及机制：传代培养的大鼠肝星状细胞HSC-T6与蕲艾提取液药物血清(5%、10%、20%)共同培养24小时后,采用MTT法检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞周期及Western-blot、实时荧光定量RT-PCR检测Cyclin D1蛋白及其mRNA的表达。 2.蕲艾提取液药物血清对大鼠肝星状细胞凋亡的影响及机制：采用Annexin V/PI双染结合流式细胞仪检测HSC-T6凋亡及Western-blot、实时荧光定量RT-PCR检测抗凋亡基因Bc1-2 mRNA及蛋白的表达。 3.蕲艾提取液药物血清对大鼠肝星状细胞TGFβ1-Smad信号转导途径的影响：Elisa检测TGFβ1蛋白表达、Western-blot及实时荧光定量RT-PCR检测TGFβ1、Smad3、Smad4、Smad7蛋白及其mRNA表达。 [结果] 1.在细胞外基质方面：蕲艾提取液各治疗组与同期模型组相比,肝纤维化程度明显减轻。肝纤维化模型组Ⅰ、Ⅲ型胶原及TIMP-1含量比正常对照组明显增加(P0.01),蕲艾口服液各治疗组Ⅰ、Ⅲ型胶原及TIMP-1含量比模型组明显减少(P0.05,P0.01)。 2.在细胞增殖方面：不同浓度蕲艾提取液药物血清(5%、10%、20%)与空白对照组及生理盐水血清各组比较,均能显著抑制HSC-T6增殖(P0.01),其抑制作用呈浓度依赖关系。流式细胞仪分析显示,蕲艾提取液药物血清组G0／G1期细胞显著增加(P0.05,P0.01),而S期细胞显著下降(P0,05,P0.01),但对于G2期无影响。细胞凋亡率显著升高(P0.05,P0.01)。同时蕲艾提取液药物血清可明显抑制cyclin D1 mRNA及其蛋白表达(P0.01),而且随血清浓度的增加,抑制作用增强,呈现剂量依赖关系。 3.在细胞凋亡方面：蕲艾提取液药物血清组HSC-T6早期细胞凋亡率显著高于空白对照组及生理盐水血清组(P0.01),并且随着血清浓度的增加,HSC-T6早期细胞凋亡率逐渐增高,呈剂量依赖关系。同时蕲艾提取液药物血清组可下调抗凋亡基因Bcl-2 mRNA及蛋白表达(P0.05,P0.01),而且随血清浓度的增加,Bcl-2 mRNA及其蛋白表达降低,呈现剂量依赖关系。 4.在细胞TGFβ1-Smad信号转导通路方面：与空白对照组及生理盐水血清组相比,蕲艾提取液药物血清可显著抑制HSC TGFβ1、Smad3、Smad4蛋白及其mRNA表达(P0.05,P01.01),上调Smad7蛋白及其mRNA表达(P0.05,P0.01),而且随药物血清浓度的增高对HSC-T6 TGFβ1、Smad3、Smad4蛋白及其mRNA表达的抑制程度逐渐增强,而Smad7蛋白及其mRNA表达逐渐升高,呈现剂量依赖关系。 [结论] 1.蕲艾提取液能够下调Ⅰ、Ⅲ型胶原及TIMP-1mRNA表达,减少肝内胶原物质的过度沉积。 2.蕲艾提取液药物血清能够抑制HSC增殖,促进HSC的凋亡。 3.蕲艾提取液药物血清能够下调HSC TGFβ1、Smad3、Smad4蛋白及其mRNA表达,上调Smad7蛋白及其mRNA表达。 4.蕲艾提取液抗肝纤维化的作用机制可能是抑制HSC的增殖,促进HSC的凋亡,调控Smad相关蛋白及其mRNA表达,减少肝脏细胞外基质的沉积而实现的。