姜黄素抑制子宫内膜异位症雌激素生成的实验研究

【摘要】： 目的： 建立子宫内膜异位症(Endometriosis, EMT)体外模型,探讨雌激素(estradiol, E2)高水平生成的组织来源；观察姜黄素(Curcumin,Cur)干预后对异位内膜细胞增殖的影响,Cur对EMT异位内膜细胞E2生成水平的变化,初步探讨Cur治疗EMT的疗效及抑制E2生成的作用机制。方法： 首先建立EMT异位内膜细胞体外模型,采用改良细胞消化法和组织块贴壁法混合培养EMT和非EMT内膜细胞,用离心法和筛网法对腺上皮细胞和间质细胞进行分离培养。将分离与混合培养的内膜细胞E2生成水平进行比较,明确高水平E2的组织来源；再次混合培养EMT异位内膜细胞,加入终浓度为10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L50μmol／L的姜黄素,进行药物干预,设置0h、24h、48h、72h和96h五个时间点,观察姜黄素对内膜细胞体外生长的影响及不同时间点对EMT内膜细胞E2生成的影响。本实验分为非EMT组、EMT组、姜黄素组,0.1μmol／L来曲唑作为西药对照组。用电化学发光免疫法分别检测各组培养液上清中E2生成水平。 结果： 1、改良的细胞消化法成功建立EMT组和非EMT组体外模型。倒置显微镜下可见,间质细胞4h后开始贴壁,出现极性生长,伸出伪足。腺上皮细胞贴壁较晚,12h后开始贴壁。传代后细胞贴壁良好,生长稳定,间质细胞可进行6～7次传代,细胞的纯度与细胞传代数呈正比,可以传至第8代。腺上皮细胞数目明显减少,不易清晰辨认,不能继续传代。细胞消化法成功率为非EMT组100%,EMT组为89%。腺上皮细胞传至第1代,间质细胞传至第8代。 2、组织块贴壁法成功建立EMT组和非EMT组体外模型,镜下可见24h后细胞才开始贴壁,生长缓慢,形态结构良好；48h后腺体结构开始变形,致密的腺上皮细胞结构开始松散；3d后部分腺上皮细胞变形崩解,偶有间质细胞坏死。传代后,间质细胞形态清晰可辨,腺上皮细胞失去正常形态难以辨认。细胞贴壁法成功率为非EMT组83%,EMT组为78%,腺上皮细胞传代未成功,间质细胞传代至第4代。 3、用离心法和筛网法分离培养内膜细胞,筛网分离法所得的细胞纯度明显高于细胞离心法。电化学发光免疫法检测第3代间质细胞和第1代腺上皮细胞培养液上清中E2水平,非EMT组间质细胞的E2水平为0.87±1.13 pg／ml,腺上皮细胞E2水平为1.06±0.49pg／ml；EMT组间质细胞的E2水平为9.34±1.37pg／ml,腺上皮细胞E2水平为12.90±0.65pg／ml。 4、混合培养内膜细胞,用电化学发光免疫法检测非EMT组和EMT组原代细胞培养液上清中E2生成水平。非EMT组内膜细胞分泌的E2水平为1.34±1.57pg／ml,EMT组内膜细胞E2分泌水平为16.82±1.04pg／ml。结果显示,EMT组E2分泌水平明显高于非EMT组,混合培养EMT内膜细胞组明显高于分离培养EMT组。 5、混合培养EMT组内膜细胞,50μmol／L的姜黄素干预后的EMT内膜细胞分泌E2的水平明显下降,24h、48h、72h和96h的E2生成水平分别较前一时间点增长33.18%、57.28%、38.80%和12.45%。10μmol／L的姜黄素干预后的EMT内膜细胞E2的生成水平随着时间的延长而增加,24h、48h、72h和96h雌激素生成的水平分别较前一时间点增长22.7%、34.9%、40.3%、47.6%。结果显示,Cur干预后的EMT内膜细胞较未干预前E2的生成水平均有所下降。其中,50μmol／L的姜黄素在作用96h后,内膜细胞E2生成水平最低,呈现时间依赖性改变。不同剂量的姜黄素干预后内膜细胞E2生成水平随着药物剂量的增大而分泌下降,呈现剂量依赖性改变。 结论： 1、通过改良细胞消化法和组织块贴壁法均可成功的建立EMT体外模型。改良细胞消化法的成功率明显高于组织贴壁法。 2、EMT组内膜细胞分泌E2的水平明显高于非EMT组内膜细胞。EMT组间质细胞和腺上皮细胞均有E2生成,腺上皮细胞在内膜细胞E2的分泌中占主导地位。 3、EMT组混合培养内膜细胞E2生成水平明显高于分离培养内膜细胞。与非EMT内膜细胞组相比,有显著统计学差异。 4、EMT异位内膜细胞体外生长速度和数量明显高于非EMT组(P＜0.05)。姜黄素干预后的EMT组较为用药物干预的对照组相比,细胞数量未见明显统计学差异(P0.05)。 5、姜黄素可抑制EMT体外模型中内膜细胞局部E2的表达水平,呈时间和剂量依赖性改变。