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稀有鲍鲫dead end基因的克隆及其功能研究

段俊丹  
【摘要】:稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)作为一种小型鲤科鱼类,已成为我国一种新型理想的实验模式动物,但是关于稀有鮈鲫生殖细胞的发生和性腺分化的机制还不是很清楚,有关稀有鮈鲫dead end (dnd)基因的克隆、表达模式以及功能的研究至今未见报道。本研究首先克隆稀有鮈鲫dnd基因的保守片段以及全长序列,进行了序列的比对分析;其次研究了dnd基因在稀有鮈鲫各个组织以及胚胎不同发育时期的表达情况;同时合成了地高辛标记的RNA探针,通过胚胎整体原位杂交观察dnd基因在胚胎中的表达及迁移的情况;最后构建了pCS2+-dnd组质粒,进行dnd dsRNA以及dnd mRNA的体外转录,以期研究稀有鮈鲫dnd基因对生殖细胞发育的影响。通过dnd基因的研究提供鱼类生殖细胞新的标记基因,利于今后的基础和应用研究,为以dnd为目标的全雄鱼或不育转基因鱼的培育提供基础资料。 一、采用RT-PCR和SMARTerTM RACE-PCR扩增技术,得到了稀有鮈鲫dnd基因1718bp的全长cDNA序列,其中5’非编码区80bp,3’非编码区471bp,开放阅读框为1167bp,共编码388个氨基酸残基,含一个由73个氨基酸残基组成的RRM结构域。将稀有鮈鲫与代表性物种的Dnd氨基酸序列进行多重序列比对以及系统进化分析,结果发现,Dnd具有很强的保守性,除了特有的RRM结构域外,还包含5个保守结构域,1个N-末端区域和4个C-末端区域,其中RRM为主要的功能结构域。 二、运用RT-PCR技术,分析稀有鮈鲫dnd基因的表达模式。RT-PCR结果显示,dnd基因特异性地在稀有鮈鲫的性腺中表达,并且dnd基因在卵巢中的表达量高于精巢中的表达量,但没有显著性的差异(P0.05)。推测,dnd基因在稀有鮈鲫性腺发育和分化过程中起重要的作用。在胚胎发育阶段,dnd基因在胚胎的整个发育过程中持续表达,从胚胎的合子期一直到囊胚期,dnd基因维持较稳定的高水平表达;从原肠胚期表达量有所下降,在出苗期达到了最低水平,并且合子期到囊胚期的表达较之后几个时期的表达差异极显著(P0.01)。推测,稀有鮈鲫的dnd基因是一个母源性基因,在整个胚胎发育以及PGCs的迁移过程中起着重要的作用。 三、合成地高辛标记的RNA探针,进行胚胎整体原位杂交。结果显示,稀有晌鲫dnd mRNA信号在胚胎2-细胞期的卵裂沟形成两个信号点,在4-细胞期的卵裂沟变成四个点,从3h开始,dnd mRNA的信号向下迁移,4h、6h之后对齐分布在胚轴的两边,最终迁移进入性腺;其中在2-细胞到4h期间,稀有鮈鲫dnd基因的表达量较高,6h开始表达信号有所下降,验证了dnd基因在胚胎不同发育时期表达的RT-PCR结果,并且与稀有鮈鲫vasa基因的表达特点、表达位点以及在性腺中迁移的情况一致,说明了dnd基因为稀有鮈鲫生殖细胞特异性表达的基因,可能参与PGCs的迁移及配子的发生,在性腺发育和生殖细胞分化的过程中具有重要的作用。 四、构建pCS2+-dnd重组质粒,进行dnd dsRNA以及dnd mRNA的体外转录,以期研究稀有鮈鲫dnd基因对生殖细胞发育的影响。


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