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单核细胞增生李斯特菌生物被膜形成机制的转录水平研究

尚俊丽  
【摘要】:古人云“民以食为天”,食品是人类赖以生存和发展的最直接的物质条件。中国还有句俗语“病从口入”,食品安全关系到全人类的生活、生存、延续,是人类发展的重要课题。近些年来,食品问题逐步演变成一个社会热点问题。然而在众多食品问题中微生物引起的食源性疾病是影响食品安全最主要的因素之一。食品及原料表面、管道、运输设备等表面通常富含营养物质,微生物易在此生长繁殖,形成生物被膜。一旦形成生物被膜,对消毒剂、杀菌剂的耐受性增强而难以清除,并严重影响着食品卫生安全,因此对生物被膜的研究刻不容缓。 食源性致病菌单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)能形成生物被膜,纵观国内外的研究,对Lm生物被膜的研究主要集中在以下几个方面:1)建立实验室培养和检测Lm生物被膜的标准方法以及分析培养条件(营养、温度、接触面材料性质等)对Lm生物被膜形成的影响;2)比较不同来源(比如即时食品、水产品、临床等)、不同血清型或者致病谱系(Lineage)的Lm分离株的生物被膜形成能力和形态上的差别;3)利用各种转座系统获得生物被膜形成突变株,研究Lm生物被膜形成的相关基因;4)研究PrfA、SigB等主要调控因子对生物被膜形成的影响机制。 本实验室前期研究成果表明Lm毒力基因表达的主要调控蛋白PrfA能促进Lm生物被膜的形成,但具体的分子机制还未阐明;前期结果还显示PrfA活性高低以及培养基营养丰富程度对PrfA在Lm生物被膜形成中有显著影响,而根据我们的蛋白质组学结果推测碳代谢物阻遏效应(Carbon Catabolite Repression, CCR)的调控因子CcpA可能参与调控Lm生物被膜形成,因此,本实验利用检测转录水平的有效手段——qRT-PCR探究CcpA和PrfA之间的关系,结果显示CcpA与PrfA的转录表达可能存在负调控的关系。 本实验还利用微阵列技术比较研究了EGDe游离态、被膜态及EGDe△PrfA被膜态全基因组转录表达的差异,寻找与Lm生物被膜形成相关的基因以及与PrfA的联系,解析PrfA促进Lm生物被膜形成的分子机制。我们的研究显示:1)营养条件对细菌生物被膜相关基因的表达影响巨大。与Lm游离菌的全基因转录水平相比,在营养丰富的BHI培养基中,培养了48h后形成的生物被膜细胞的全基因组转录表达水平十分低下,该条件检测出的样本信号值强度的中位值和平均值均远远低于其他样本;而在营养相对贫瘠的基础培养基MEM(添加葡糖糖)中,超过21.95%(即所检测的2857个基因中发现627个Lm生物被膜形成相关基因)的基因在游离菌和被膜菌中发生差异表达;2)在627个Lm生物被膜形成相关基因中,有185个基因的转录表达在PrfA缺失菌株形成的生物被膜中发生了改变。其中,只有10个基因因为PrfA缺失而增强了差异表达的绝对值,而其余175个基因的表达却发生根本的改变,即在野生株形成的生物被膜中上调的基因在PrfA缺失株形成的生物被膜中却下调,反之亦然。PrfA的缺失改变了很多与Lm生物被膜形成相关基因的表达,暗示PrfA调控Lm生物被膜形成可能是多基因多途径相互协调作用的结果。 本实验还分别选择了微阵列结果中与Lm生物被膜形成相关基因中的8个基因做了荧光定量PCR检测以及19个基因做了半定量RT-PCR验证,检验结果与芯片结果显示的变化趋势是吻合的。 在今后的工作中我们将挑选多个与Lm生物被膜形成相关基因进行深入研究,观测这些基因在缺失及回复条件下生物被膜的形成情况及与PrfA活性的关系。通过这些基础研究我们将要解析与PrfA相关的、影响生物被膜形成的关键基因的功能,阐明PrfA调控Lm生物被膜形成的途径和分子机制,进而深入了解Lm的致病机理,为预防和治疗李斯特菌病、食品的生产加工、保存及检测提供新的思路和理论依据。


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