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豆野螟性信息素结合蛋白MvitPBPs基因的鉴定及功能分析

毛阿萍  
【摘要】:昆虫在竞争激烈的自然环境中不断繁衍生存,主要受益于其敏锐的嗅觉系统。昆虫通过发达的嗅觉系统感知同类或天敌发出的性信息素或预警信息素,不仅能寻找配偶进行交配和躲避天敌,还能通过感知寄主植物发出的挥发性信息素进行寄主识别和产卵定位等。昆虫嗅觉系统中OBPs起着重要的作用,鳞翅目昆虫根据OBPs的特点将其分为两类:GOBPs和PBPs, PBPs在昆虫两性交流中扮演着重要的角色。豆野螟是广泛危害豆类作物的世界性农业害虫,主要分布于热带及亚热带地区。以幼虫的钻蛀行为而闻名,主要危害豆科植物幼嫩的花、豆荚等。课题组前期进行了豆野螟触角转录组测序,本研究通过生物信息学技术和分子生物学方法分析利用转录组数据扩增得到3个PBPs基因,qRT-PCR分析检测PBPs基因在不同组织和全身的表达谱,之后体外原核表达纯化目的蛋白并利用荧光竞争结合实验初探其生理功能,结果如下:1、豆野螟MvitPBPs的克隆、序列和进化分析基因克隆得到三个PBPs,并将其命名为MvitPBP1、MvitPBP2、MvitPBP3,分析得出MvitPBPs ORF分别为495,501,519 bp。多重序列比对显示:MvitPBP1与BmorPBP1的序列一致性为47.27%,MvitPBP2与AtraPBP2的序列一致性为48.82%, MvitPBP3与Apo1PBP3的序列一致性为43.03%。系统进化分析得出:MvitPBP1与二化螟CsupPBP1聚为一支,MvitPBP2与亚洲玉米螟OnubPBP4聚为一支,MvitPBP3与稻纵卷叶螟CmedPBP2聚为一支。2、荧光定量表达谱分析利用qRT-PCR检测MvitPBPs在不同组织以及全身的表达水平,结果表明:三个基因主要在嗅觉感器集中分布的触角中表达,并相对其他组织具有明显的差异性;其表达水平同时具有性别差异性,MvitPBP1偏雄性表达,MvitPBP2和MvitPBP3偏雌性表达,推测此类基因在豆野螟行为反应中发挥着不同的功能。3、MvitPBPs原核表达及纯化为初步探究MvitPBPs的功能采用原核表达技术体外表达目的蛋白。首先构建原核表达载体pET32a(+)-PBPs,再将重组质粒转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导蛋白表达至上清,之后Ni柱亲和层析纯化目的蛋白,最后肠激酶切除His标签。SDS-PAGE表明三个蛋白大小都几乎接近27kDa,并在图上呈现出较粗的条带。4、荧光竞争结合实验首先测定MvitPBPs与豆野螟4种性信息素的结合特性,结果表明MvitPBPs与4种性信息素都能发生结合。MvitPBP1与MvitPBP3对E10E12-16:A1d的结合力最强,而MvitPBP2偏好E10-16:Ald,说明这两种成分可能是豆野螟性信息素的主要组分,MvitPBPs对烯醛类化合物有较高的偏好性。其次检测MvitPBPs与19种豇豆花挥发物的结合特性,结果表明MvitPBP1和MvitPBP2能与挥发物结合,但结合能力较弱,未表现出明显的差异性。MvitPBP3则能显著结合Butanoic acid octyl ester(丁酸辛酯),与本课题组前期在研究MvitGOBP2功能时得出MvitGOBP2与丁酸辛酯的结合能力最强相似。综上所述,豆野螟MvitPBPs与其他鳞翅目昆虫PBPs表现出的功能类似,在两性识别中扮演着重要的角色,其中MvitPBP1发挥的作用极其显著。MvitPBP3还能与豇豆花挥发物Butanoic acid octyl ester发生极特异性结合,在豆野螟寻找寄主或产卵场所方面起到一定的辅助作用。


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