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基于蛋白激酶的新型潜在除草剂靶标的克隆、表达和纯化

陈琴  
【摘要】:除草剂以其经济、高效、广谱等特点在农业生产中发挥着重要的作用。但由于长期使用单一作用机制和靶标的除草剂品种,使得杂草的抗药性问题、环境问题以及非靶标生物安全性问题日益严重。因此,为研发出更加环境友好、低毒、高效的除草剂,寻找新型作用靶标已成为当前重要的研究课题。蛋白激酶已成为药物设计的重要靶标,而在农药靶标的研究中则鲜有报道。因此,开发以蛋白激酶作为靶标的除草剂是一项非常有意义的工作,将会为新型除草剂靶标的选择和研究提供新的可能。本论文在借鉴医药开发的成功经验上,继本课题组前期通过序列比对等生物信息学方法,从模式植物拟南芥基因组序列中筛选出具有潜在除草剂作用靶标价值的蛋白激酶基因的基础上,采用聚合酶链式反应(PCR)从拟南芥cDNA文库中扩增出10个靶标基因,然后采用基因克隆技术将目的基因连接至表达载体,构建出了相应的重组表达质粒和工程菌,继而对靶标蛋白的表达条件进行了筛选和优化,纯化出5个重组蛋白,并采用高效液相色谱法,通过检测激酶磷酸化反应过程中ATP的消耗量和ADP的生成量,证实了纯化后的激酶蛋白具有生物活性,这为后续培养蛋白质晶体、解析蛋白结构奠定了基础。


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