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三种螟虫PBPs的功能分析及其性信息素合成酶基因的初步筛选

房耐耐  
【摘要】:甘蔗条螟(Chilovenosatus Walker)和红尾白螟(Tryporyza intacta Snellen)是热带及亚热带地区为害甘蔗的主要害虫,稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenee)是具有迁飞性的世界性水稻害虫,在我国南北方水稻产区均有分布。目前主要以化学防治为主,但化学农药的滥用和残留对生态及土壤环境的破坏尤为严重,筛选绿色高效的环保替代药剂十分必要。以信息素为靶标的生物防治手段,具有高效、无污染的特点,成为害虫防控的研究热点之一。目前对于甘蔗条螟、稻纵卷叶螟和红尾白螟化学感受机制的研究尚少,本研究以其性信息素结合蛋白为研究对象,分别对CvenPBPs、CmedPBPs和TintPBPs各基因进行了克隆表达及功能鉴定,探究其与性信息素的结合能力和关键作用位点;同时对三种螟虫雌蛾信息素腺体进行转录组测序分析,筛选到大量与性信息素合成相关的酶类基因。研究结果为甘蔗条螟、稻纵卷叶螟和红尾白螟的生物防治及雌蛾性信息素合成通路的比较研究提供了基础性资料,同时为研究昆虫与寄主植物互作和协同进化提供了更多科学依据。本研究取得的主要结果如下:(1)利用 RT-PCR 技术扩增出 CvenPBP1-3、CmedPBP1-3 和 TintPBP1-3 基因全长cDNA序列,并利用原核表达获得嗅觉蛋白CvenPBPs、CmedPBPs和TintPBPs,之后采用荧光竞争结合实验检测PBPs和性信息素的结合特性。结果表明,甘蔗条螟CvenPBPs与3种性信息素的结合能力都比较强,CvenPBP1和CvenPBP2对Z13-18:AC亲和力十分显著,它们的Ki值分别为1.01 μM和1.57 μM,而CvenPBP3与Z13-18:OH的结合能力比较强,其Ki值为1.87μM。CmedPBP1与三种性信息素结合能力较弱,CmedPBP2和CmedPBP3能有效结合3种性信息素,CmedPBP2对Z13-18:OH亲和力十分显著,它的Ki值为0.97 μM,而CmedPBP3与Z16-18:AC的结合能力较好,其Ki值为1.76 μM。TintPBP3与性信息素结合能力不及TintPBP1和TintPBP2,TintPBP1和TintPBP3与反式十六醛的结合能力较强,而TintPBP2与顺式十六醛的结合能力较强。(2)蛋白多重序列比对发现3个CvenPBPs序列一致性为50.60%,3个CmedPBPs序列的一致性为50.20%,而3个TintPBPs序列一致性相对较低,只有35.26%。CvenPBP1 与 CmedPBP1 序列一致性为 59.39%,CvenPBP2 与 CmedPBP2序列一致性为55.49%,CvenPBP3与CmedPBP3序列一致性为42.18%。进化分析表明:CvenPBPs、CmedPBPs和TintPBPs与鳞翅目螟蛾科的PBPs同源性较高,且鳞翅目昆虫的PBPs显著分为两支,其中PBP1和PBP2聚为一只,PBP3单独一支,结果与PBPs多重序列比对结果相对应,与前人的研究结果一致。(3)同源建模显示,CvenPBPs和CmedPBPs具有OBPs家族的典型结构,都具有6个α螺旋结构。分子对接实验表明,Glu40、Leu43和Tyr41可能在CmedPBP1与性信息素的结合中发挥重要作用,在CmedPBP2与性信息素的结合中发挥重要作用的氨基酸位点是Ser111和Ser56,CmedPBP3与性信息素的结合中发挥重要作用的氨基酸位点是Tyr28和Leu43。与稻纵卷叶螟CmedPBP1相似,Leu43和Tyr41在CvenPBP1与性信息素的结合中发挥重要作用,在CvenPBP2与性信息素的结合中发挥重要作用的氨基酸位点是Ser43和Ile52,在CvenPBP3与性信息素的结合中发挥重要作用的氨基酸位点是Leu24、Tyr28和Ser1。(4)在甘蔗条螟、稻纵卷叶螟和红尾白螟信息素腺体的转录组数据中分别筛选到74、107、106个与性信息素合成相关的酶类基因,包括以下9类:乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合酶(FAS)、脂肪酸辅酶A还原酶(FAR)、去饱和酶(DES)、乙酰辅酶A氧化酶(ACO)、醇氧化酶(AOX)、醛脱氢酶(ADH)、酰基转移酶(ATF)和羧酸酯酶(CEX)。(5)甘蔗条螟、稻纵卷叶螟和红尾白螟ACCs、FASs、FARs和DESs的进化分析结果表明,CvenACC1与CmedACC1聚为一支,CvenFAS1与CmedFAS1聚为一支。CvenFAR1 与 CmedFAR1,CvenFAR2 与 CmedFAR2,CvenFAR3 与CmedFAR3,CvenFAR4与CmedFAR4分别聚为一支。DESs是性信息素合成过程中决定最终性信息种类的关键因素之一,进化树分析发现,CvenDES1与CmedDES1,CvenDES2 与 CmedDES2,CvenDES3 与 CmedDES3 分别聚为一支。鳞翅目昆虫DESs分为三支:A9-DES,△11-DES,而三种螟虫的脱饱和酶基因大多单独聚为一支。


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