大熊猫非损伤性样品DNA的提取和SSR标记的分离

【摘要】：大熊猫是世界上著名的濒危物种之一，是中国的国宝，对其保护性研究得到了世界范围的广泛关注。目前，大熊猫所面临的问题主要是：种群数量少、分布狭窄、遗传多样性贫乏、存在较为严重的近亲繁殖和生殖能力差。解决这些问题，制定正确的繁育计划，维护并促进大熊猫的生境状况是当务之急。SSR标记能作为分析和解决这些问题的最有效的工具，得到了相关领域研究人员的认可。但是，大熊猫基因组SSR标记的开发工作开展甚少，目前仅仅36个位点被分离。此外，对大熊猫进行相关的分子遗传分析，获取基因组DNA相当困难，因此，其相关工作很难在各个实验室得到广泛开展。针对上述有关问题，本文以大熊猫血液、毛发和粪便为材料，进行了非损伤性样品DNA的提取研究和SSR标记的分离工作，主要结果如下： 1．在粪便DNA的提取过程中采用一个新的预处理方法，将粪便用预冷的丙酮洗2～3次，除去粪便中含有的大量PCR抑制物，然后蛋白酶K裂解、酚-氯仿抽提，能提取到纯度很高的DNA供PCR扩增。本实验PCR扩增了大熊猫脑源性神经营养因子(BDNF)基因和线粒体细胞色素b基因片段，并进行测序分析，证实了提取的可靠性。对比本方法和未经丙酮预处理的方法提取的DNA进行PCR扩增，前者的扩增结果明显优于后者。 2．以血样DNA为材料，用两种以PCR为基础的分离SSR的方法(RAMS和MP-PCR)分离大熊猫的SSR标记，RAMS策略获得3个(其中只有一个是很好的SSR)，MP-PCR策略获得17个(其中只有三个含两侧的保守序列，其余均只有一侧的保守序列)。通过比较分析这两种方法，建立了一种简单的从毛发DNA中快速分离SSR标记的方法，并分离到四个非常好的SSR位点。