褪黑素修饰超氧化物歧化酶及其性质的初步研究

【摘要】：关于超氧化物歧化酶的化学修饰，国内外学者已做了较多且较为深入的研究。修饰后的SOD与修饰前比较，其稳定性大大提高，并且免疫原性降低或消除，是酶分子改造中一个较为成功的方面。本文在前人研究的基础上，拓展了关于SOD化学修饰的新思路：在对SOD进行分子改造的同时，着重于扩展其功能，使之成为具备复合型功能的酶分子。本文选用了具备清除自由基、增强免疫等功能的褪黑素作为修饰剂对SOD进行改造。 在自由基代谢中，SOD能够特异性的清除超氧阴离子(O_2~-)，但是对于由O_2~-反应产生的其他更具危害性的自由基如：·OH、ONOO~-等却无能为力。而MT就具备清除·OH、ONOO~-的能力。如果能将二者结合起来，得到的MT-SOD理论上会具备更强的清除自由基的能力。 为了将MT与SOD分子偶联，本文借鉴了免疫学中MT免疫原的制备方法。以甲醛作为偶联剂，将MT连接到SOD分子表面的游离氨基上。 由于甲醛能使SOD失活，于是对甲醛的反应浓度进行了筛选，结果表明选用浓度为0.250g/100ml的甲醛作为偶联剂进行化学修饰的效果较为理想。 修饰反应完成后，用丙酮沉淀、透析等方法将反应物分离纯化，根据MT和SOD的性质确立了一套快速检测MT连接效率的实验方法，并能够计算出每个SOD分子上连接了6-9个MT分子。通过检测，结果表明得到的MT-SOD保留了60％的SOD活性，而且1000ug／ml的MT-SOD(含60-90ug／ml的MT)清除·OH的能力与70ug／ml的MT相当，表明修饰后MT的活性几乎完全保留。结果表明MT已成功与SOD偶联，MT-SOD同时具备了MT以及SOD的生理活性。 将猪血SOD和MT-SOD在75℃下保温不同时间，测定两者的酶活。实验发现保温70min，MT-SOD还保留有61.3％的活性，而天然SOD的活性只剩余35.2％。说明MT-SOD与天然的SOD相比，对温度有更强的抗性，热稳定性增强。