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褪黑素修饰超氧化物歧化酶及其性质的初步研究

何毅  
【摘要】:关于超氧化物歧化酶的化学修饰,国内外学者已做了较多且较为深入的研究。修饰后的SOD与修饰前比较,其稳定性大大提高,并且免疫原性降低或消除,是酶分子改造中一个较为成功的方面。本文在前人研究的基础上,拓展了关于SOD化学修饰的新思路:在对SOD进行分子改造的同时,着重于扩展其功能,使之成为具备复合型功能的酶分子。本文选用了具备清除自由基、增强免疫等功能的褪黑素作为修饰剂对SOD进行改造。 在自由基代谢中,SOD能够特异性的清除超氧阴离子(O_2~-),但是对于由O_2~-反应产生的其他更具危害性的自由基如:·OH、ONOO~-等却无能为力。而MT就具备清除·OH、ONOO~-的能力。如果能将二者结合起来,得到的MT-SOD理论上会具备更强的清除自由基的能力。 为了将MT与SOD分子偶联,本文借鉴了免疫学中MT免疫原的制备方法。以甲醛作为偶联剂,将MT连接到SOD分子表面的游离氨基上。 由于甲醛能使SOD失活,于是对甲醛的反应浓度进行了筛选,结果表明选用浓度为0.250g/100ml的甲醛作为偶联剂进行化学修饰的效果较为理想。 修饰反应完成后,用丙酮沉淀、透析等方法将反应物分离纯化,根据MT和SOD的性质确立了一套快速检测MT连接效率的实验方法,并能够计算出每个SOD分子上连接了6-9个MT分子。通过检测,结果表明得到的MT-SOD保留了60%的SOD活性,而且1000ug/ml的MT-SOD(含60-90ug/ml的MT)清除·OH的能力与70ug/ml的MT相当,表明修饰后MT的活性几乎完全保留。结果表明MT已成功与SOD偶联,MT-SOD同时具备了MT以及SOD的生理活性。 将猪血SOD和MT-SOD在75℃下保温不同时间,测定两者的酶活。实验发现保温70min,MT-SOD还保留有61.3%的活性,而天然SOD的活性只剩余35.2%。说明MT-SOD与天然的SOD相比,对温度有更强的抗性,热稳定性增强。


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