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AcMNPV ORF9和HaSNPV ORF2的功能研究

聂英超  
【摘要】: 杆状病毒是一类双链环状DNA病毒,作为生物防治杀虫剂及高效外源蛋白表达载体得到广泛研究。近来有许多学者致力于杆状病毒作为基因治疗载体的研究。杆状病毒基础理论的研究不仅有助于对病毒自身的了解,而且为更好的利用杆状病毒提供了契机。对HaSNPV ORF2以及其同源基因AcMNPV ORF9的序列进行分析,结果表明,AcMNPV P78/83及HaSNPV ORF2蛋白具有WASP蛋白家族的保守功能区:Pro-rish区、WH2区、Acidic区以及Coffilin区。据此,我们推测它们可能在病毒粒子的包装运输中发挥作用。本文对AcORF9与HaORF2的结构与功能进行了研究,共包括三章。 第一章对杆状病毒的研究作了综述性介绍,包括杆状病毒的分类地位、复制周期、基因组特征、已报道的保守基因、已经鉴定基因的功能以及杆状病毒的应用,本文的研究背景与研究目的。 第二章介绍了本文中应用的所有材料与方法。 第三章介绍了本文实验研究的结果与讨论,分三节对AcORF9和HaORF2的研究结果进行了阐述和讨论。 第一节对Ac9的功能研究进行了报道。通过Bac-to-Bac系统构建Ac9与EGFP融合表达的重组病毒vAc-orf9-gfp,对重组病毒表达的融合蛋白进行了亚细胞定位分析,以及与actin共定位的分析。结果表明,从感染后24h即可观察到P78/83-EGFP融合蛋白从细胞质定位转移到细胞核,并且随着感染的加深,融合蛋白在细胞核中被包装入病毒粒子。共定位分析表明,P78/83很可能与actin存在共定位关系。对vAc-orf9-gfp感染Sf21细胞作电镜时相切片分析,结果表明,表达P78/83-EGFP融合蛋白的重组病毒,对病毒粒子的形态发生没有明显可见的影响。 第二节对Ha2基因的结构与功能的研究进行了报道。Ha2蛋白感染HzAMI细胞后24h可以检测到蛋白表达,表明Ha2是晚期表达基因。构建了Ha2与绿色荧光蛋白融合表达的重组病毒vHa-orf2-gfp,对该重组病毒感染细胞后,融合 篡 硕士学位论文 MAST卜R’S’r拼IFS!S 蛋白在HzAMI细胞进行了亚细胞定位分析,以及与actin共定位的分析,结果 表明,HaZ与GFP融合后,到感染晚期定位于细胞核中,这与HaZ结构蛋白 的特性相符。并且,在感染HzAMI细胞时,观察到融合蛋白与actin的共定位, 尤其是感染后36h,共定位现象更明显。 第三节主要介绍HaZ与Acg的功能进行比较研究。构建了表达HaZ与Acg 两个同源基因的重组病毒vAc-HaZ一g印。HaZ一EGFP蛋白亚细胞定位发现, HaZ一EGFP蛋白始终近乎均匀的分布于整个细胞,类似与仅表达EGFP病毒荧 光在细胞中的分布。感染细胞时相电镜切片,感染sf21细胞12h到72h,病毒 粒子的形态发生正常,而在感染后96h,除了正常形态的病毒粒子外,部分细 胞中可见较正常病毒粒子长数倍的病毒粒子。尝试了采用线性重组系统进行在 vAc一HaZ一gfP基础上缺失P78/83基因。 宿主肌动蛋白在杆状病毒的运输及子代病毒粒子的装配过程中,可能具有 十分重要的作用,但相关的研究确很少。本文的研究不仅解释了AcMNPV ORFg及HaORFZ的结构与功能,而且还为进一步揭示杆状病毒与宿主细胞相 互作用的特殊性研究奠定基础。


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