丙酮酸脱羧酶基因的克隆与表达

【摘要】：丙酮酸脱氢酶复合体是a-酮酸脱氢酶复合体家族中重要的一员,它是由丙酮酸脱羧酶(E1)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(E2)和二氢硫辛酸脱氢酶(E3)三种不同的酶及TPP、硫辛酸、FAD、NAD~+、CoA和Mg~(2+)6种辅助因子组装而成。丙酮酸脱氢酶复合体在线粒体中催化丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA,而乙酰CoA再进入三羧酸循环被彻底的氧化分解,从而为生物体的生命活动提供必要的能量。丙酮酸脱羧酶参与丙酮酸氧化脱羧过程中第一步反应,这一步是整个反应中唯一的不可逆反应。如果此酶的活性受到抑制,则生物体的有氧代谢受阻,导致生物体内不能充分地利用氧,细胞的呼吸作用也会受到了严重的阻碍。由于氧不能被充分利用,生物体内氧会积累过多,从而导致细胞内活性氧代谢的失衡,即增加了活性氧,如超氧阴离子、单线态氧等。如果这类氧自由基没能得到及时的清除,就会引起生物膜上的不饱和脂肪酸过氧化和脱膜脂作用,从而损伤或破坏膜结构,最终导致细胞死亡。如果以丙酮酸脱羧酶为靶标的抑制剂能够强有力地抑制丙酮酸脱羧酶,则导致生物体死亡。但是如何从大量的化合物中筛选出具有高活性的丙酮酸脱羧酶的抑制剂是一个有待于解决的问题。本研究试图通过基因工程的方法构建丙酮酸脱羧酶的基因工程菌,通过其表达得到大量的丙酮酸脱羧酶;并且建立快速简便的分离纯化方法,从而制备出大量的纯的有活性的丙酮酸脱羧酶,为抑制剂的筛选提供必要的靶标酶。 本实验对大肠杆菌丙酮酸脱羧酶(同二聚体类型—a2)进行了克隆和表达。也对表达得到的包涵体进行了研究。在细菌破碎之前我们使用了两种方法对收集的大肠杆菌进行处理,分别在收集的大肠杆菌中加入或者不加入非离子变性剂(SKL),然后根据载体(pGEX-KG)的特点采用亲和层析的方法得到纯化的大肠杆菌丙酮酸脱羧酶,测活结果发现前者得到的大肠杆菌丙酮酸脱羧酶活力远比后者高,其活力达到348U/ml,而后者活力只有173U/ml。 利用编码拟兰芥丙酮酸脱羧酶的a亚基和β亚基的CDS序列分别与水稻的总基因组进行序列比对,得到了与拟兰芥丙酮酸脱羧酶基因的a亚基和β亚基相对应的同源性都高于90%的两条序列,并以这两条序列来设计引物对水稻丙酮酸脱羧酶(异四聚体类型—a_2β_2)进行了克隆和表达。利用真核表达体系——酵母,通过甲醇诱导表达。在通过甲醇诱导表达后,分别得到了水稻丙酮酸脱羧酶的a亚基和β亚基,