收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

丙酮酸脱羧酶基因的克隆与表达

谭宏亮  
【摘要】:丙酮酸脱氢酶复合体是a-酮酸脱氢酶复合体家族中重要的一员,它是由丙酮酸脱羧酶(E1)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(E2)和二氢硫辛酸脱氢酶(E3)三种不同的酶及TPP、硫辛酸、FAD、NAD~+、CoA和Mg~(2+)6种辅助因子组装而成。丙酮酸脱氢酶复合体在线粒体中催化丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA,而乙酰CoA再进入三羧酸循环被彻底的氧化分解,从而为生物体的生命活动提供必要的能量。丙酮酸脱羧酶参与丙酮酸氧化脱羧过程中第一步反应,这一步是整个反应中唯一的不可逆反应。如果此酶的活性受到抑制,则生物体的有氧代谢受阻,导致生物体内不能充分地利用氧,细胞的呼吸作用也会受到了严重的阻碍。由于氧不能被充分利用,生物体内氧会积累过多,从而导致细胞内活性氧代谢的失衡,即增加了活性氧,如超氧阴离子、单线态氧等。如果这类氧自由基没能得到及时的清除,就会引起生物膜上的不饱和脂肪酸过氧化和脱膜脂作用,从而损伤或破坏膜结构,最终导致细胞死亡。如果以丙酮酸脱羧酶为靶标的抑制剂能够强有力地抑制丙酮酸脱羧酶,则导致生物体死亡。但是如何从大量的化合物中筛选出具有高活性的丙酮酸脱羧酶的抑制剂是一个有待于解决的问题。本研究试图通过基因工程的方法构建丙酮酸脱羧酶的基因工程菌,通过其表达得到大量的丙酮酸脱羧酶;并且建立快速简便的分离纯化方法,从而制备出大量的纯的有活性的丙酮酸脱羧酶,为抑制剂的筛选提供必要的靶标酶。 本实验对大肠杆菌丙酮酸脱羧酶(同二聚体类型—a2)进行了克隆和表达。也对表达得到的包涵体进行了研究。在细菌破碎之前我们使用了两种方法对收集的大肠杆菌进行处理,分别在收集的大肠杆菌中加入或者不加入非离子变性剂(SKL),然后根据载体(pGEX-KG)的特点采用亲和层析的方法得到纯化的大肠杆菌丙酮酸脱羧酶,测活结果发现前者得到的大肠杆菌丙酮酸脱羧酶活力远比后者高,其活力达到348U/ml,而后者活力只有173U/ml。 利用编码拟兰芥丙酮酸脱羧酶的a亚基和β亚基的CDS序列分别与水稻的总基因组进行序列比对,得到了与拟兰芥丙酮酸脱羧酶基因的a亚基和β亚基相对应的同源性都高于90%的两条序列,并以这两条序列来设计引物对水稻丙酮酸脱羧酶(异四聚体类型—a_2β_2)进行了克隆和表达。利用真核表达体系——酵母,通过甲醇诱导表达。在通过甲醇诱导表达后,分别得到了水稻丙酮酸脱羧酶的a亚基和β亚基,


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前18条
1 熊凌霜,马清钧;大肠杆菌不耐热肠毒素亚基基因的克隆及其基因探针的制备[J];遗传;1987年02期
2 郑峰,周志江,刘建青;大肠杆菌O157VT2 B亚基基因的克隆与表达[J];中国人兽共患病杂志;2005年02期
3 张万山,谢金平,杨华英;α-淀粉酶抑制剂的特性及亚基组成分析[J];中国生化药物杂志;2000年03期
4 孟广震,郝凤兮,钱世钧;关于大肠杆菌L-天冬酰胺酶亚基的研究[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;1984年06期
5 隋正红,张学成;龙须菜藻红蛋白亚基基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[J];高技术通讯;2001年07期
6 郭豫谊;;HBsAg基因在酵母中的表达[J];国外医学.生物制品分册;1983年05期
7 高紫云;张建鹏;;电压门控钠离子通道β4亚基的研究进展[J];生物技术通讯;2016年02期
8 郝欣;肖冬光;张翠英;;酿酒酵母类丙酮酸脱羧酶基因缺失对高级醇生成量的影响[J];微生物学报;2010年08期
9 薛全福;王振纲;;电压依赖性钙通道的α_2δ亚基和疾病及药物靶点的关系[J];中国实用医药;2007年34期
10 帅锋利;刘远厚;;大电导钙激活钾通道β_1亚基与心血管疾病[J];国际检验医学杂志;2006年05期
11 王建军;康志钰;尚勋武;;相同遗传背景下7+8与17+18亚基对小麦理化品质的影响[J];麦类作物学报;2006年04期
12 熊斌;朱月蓉;邱红;许琳;刘虹;;吸烟对外周血单个核细胞表达烟碱乙酰胆碱受体的影响[J];解放军医学杂志;2006年12期
13 陈海蛟,王浩,张立,王国民;整合蛋白α5、β1亚基在肾透明细胞癌中的表达及其临床意义[J];复旦学报(医学版);2005年05期
14 曹诚,石成华,李平,马清钧;霍乱毒素B亚基基因具有自己的启动子[J];生物技术通讯;1996年03期
15 阎翠萍;靖金莲;李世平;;小麦品质改良中5+10亚基导入规律研究[J];山西农业科学;2011年05期
16 张延滨;赵海滨;宋庆杰;于海洋;张春利;辛文利;肖志敏;;龙麦20小麦品种中7+8~*亚基和17+18亚基近等基因系间的品质差异[J];中国农业科学;2008年05期
17 李艳;郝建平;郑亚军;王将;;玉米贮藏蛋白质的提取及亚基电泳分析[J];安徽农业科学;2007年15期
18 丁锐;;黑稻种子醇溶蛋白亚基组成分析[J];陕西理工学院学报(自然科学版);2006年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张蕾;刘任强;张静;汪明;;鸡的IL-2,IL-18,IL-12基因的克隆及表达[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会论文集[C];2009年
2 李宁;毛德斌;龚一心;吕守芹;龙勉;;不同长度β_2整合素_M亚基与ICAM-1的亲和性比较[A];第九届全国生物力学学术会议论文汇编[C];2009年
3 吴永革;高赛学;陈文阳;巩威;周慧;李惟;;运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶第27位天冬氨酸突变对醛连接酶活性的影响[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
4 陶文琴;曾振灵;陈杖榴;蒋红霞;陈晓琴;吴聪明;;养殖场分离的耐氟喹诺酮类药物的大肠杆菌基因突变研究[A];中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第九次学术讨论会论文与摘要集[C];2006年
5 马瑞强;洪浩舟;张颖;陈明;林敏;;大肠杆菌乙醇代谢途径的改造和优化[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
6 梁冰;纪雪;孙洋;祝令伟;刘军;周伟;郭学军;冯书章;;出血性大肠杆菌O157:H7免疫磁性分离方法的建立[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2015年
7 尹秀玲;李苏楠;蒋禄峰;牛发良;顾小龙;白迎春;;加减三黄汤对耐药人源大肠杆菌基因表达水平的研究[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年
8 苏兰利;黄进;王金荣;张万里;张凌伟;;气管滴注大肠杆菌对肉仔鸡抗氧化性能影响的研究[A];全国动物生理生化第七届全国代表大会暨第十三次学术交流会论文摘要汇编[C];2014年
9 苏兰利;黄进;王金荣;张书杰;张万里;;气管滴注大肠杆菌对肉仔鸡肺部抗氧化性能的影响[A];全国动物生理生化第七届全国代表大会暨第十三次学术交流会论文摘要汇编[C];2014年
10 刘红梅;祁克宗;潘玲;张志强;;鸡源大肠杆菌的致病性及其感染机理[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十一次兽医病理学、第十次动物病理生理学学术研讨会论文集[C];2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘浩文;BK通道α/β1亚基相互作用机制以及β2亚基胞外结构的研究[D];华中科技大学;2015年
2 羊扬;大肠杆菌Ⅰ型群体感应功能研究[D];扬州大学;2014年
3 赵跃芳;乙酰羟酸合成酶亚基间相互作用的研究[D];南开大学;2013年
4 潘歆;GABA(A)受体亚基单核苷酸多态性与癫痫相关性的初步研究[D];复旦大学;2014年
5 姚志远;土壤中大肠杆菌O157:H7存活和微生物群落响应机制的研究[D];浙江大学;2015年
6 乔朝晖;以抗菌肽为生物识别元件快速检测大肠杆菌O157:H7的比色传感方法[D];浙江大学;2018年
7 孙曼銮;乙酰化调节大肠杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性的机制研究[D];中国科学院研究生院(武汉病毒研究所);2016年
8 张欢;氧化葡萄糖酸杆菌膜结合乙醇脱氢酶亚基Ⅲ的功能鉴定及提高菌株羟基酸合成能力的研究[D];华东理工大学;2016年
9 房敬业;粗山羊草高分子量麦谷蛋白新亚基基因的克隆、分子进化及其遗传转化研究[D];华中科技大学;2008年
10 李玉欣;毕赤酵母甘露寡糖对猪生产性能和免疫性能的影响[D];中国农业大学;2015年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 谭宏亮;丙酮酸脱羧酶基因的克隆与表达[D];华中师范大学;2006年
2 郝晓萌;重组腺伴随病毒载体表达双亚基蛋白质的研究[D];第一军医大学;2001年
3 林艺远;致猪水肿病大肠杆菌ELISA抗体检测方法及基因工程亚单位疫苗的初步研究[D];华中农业大学;2006年
4 毕哲光;野生二粒小麦表达1Ay亚基分子克隆及其序列分析[D];四川农业大学;2012年
5 雷玲;普通小麦高分子量谷蛋白亚基形成积累及遗传表现[D];西北农林科技大学;2006年
6 马雅娜;β1亚基在肿瘤发生中作用的研究[D];厦门大学;2014年
7 王晓龙;小麦高分子量谷蛋白亚基近等基因系的转育及其部分亚基品质效应研究[D];西北农林科技大学;2012年
8 周幸;裂殖酵母SAGA各亚基亚细胞荧光定位分析[D];复旦大学;2014年
9 赵晴;鸡源大肠杆菌中草药耐药抑制剂的筛选研究[D];吉林农业大学;2013年
10 闫国良;坛紫菜藻红蛋白和藻蓝蛋白主要亚基基因的克隆及其蛋白表达与纯化的初步研究[D];厦门大学;2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 耿挺;生化细胞所准确定位超大分子亚基[N];上海科技报;2018年
2 记者 盛瑜;“亚基会”官员来吐考察[N];吐鲁番日报(汉);2010年
3 佳宜;诺亚基欲引领新一代移动运算装置[N];电子资讯时报;2005年
4 南方周末记者 黄永明;谜一样的致命大肠杆菌[N];南方周末;2011年
5 记者 刘伊婷;质检总局严密防控欧洲大肠杆菌疫情传入[N];中国质量报;2011年
6 记者 李婵;人与大肠杆菌:两个世纪的孽缘[N];北京科技报;2011年
7 记者 舒适;感染大肠杆菌 法国老妇身亡[N];新华每日电讯;2011年
8 记者 陈姝 通讯员 杨晓华 曾卉;口岸未现出血性大肠杆菌疫情[N];深圳商报;2011年
9 健康时报记者  刘桥斌;大肠杆菌为何会致人死亡?[N];健康时报;2006年
10 记者  陈超;大肠杆菌有望制成生物微型马达[N];科技日报;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978