棉花GhADF基因克隆和表达分析

【摘要】：ADF/cofilins(actin-depolymerizing factor/cofilin)是肌动蛋白结合蛋白家族的一员,它广泛存在与所有的真核细胞中。许多研究表明,ADF(actin-depolymerizing factor)蛋白是肌动蛋白细胞骨架动力学组装的一个重要调节因子,而肌动蛋白骨架对细胞的伸长核顶端生长是必需的。因此分离、鉴定棉花ADF基因,然后研究其功能,并弄清楚它们的表达调控具有重要的理论意义和应用价值。 1.载体的构建与棉花的转化 利用DNA重组技术,将ADF基因克隆到pPZP221和pBI121中,分别构建了过量表达载体(overexpression vector)和RNAi(supression vector)载体。PCR扩增反应及双酶消化证实目的基因已成功插入到载体中。目前已成功将这些载体转入到农杆菌(Agrobacterium LBA4404)中,并且转化棉花。现在已经得到了一批棉花小苗。 2.基因表达分析 用改良的热酚法提取棉花发育早期各组织的RNA,对各个基因的表达进行Northern杂交分析。Northern杂交分析结果显示GhADF2在花瓣,花药和10DPA纤维中表达信号强,而在根,下胚轴,10DPA胚珠,15DPA胚珠以及20DPA胚珠中表达信号较弱。GhADF7只在花药中表达,在其他组织中没有任何信号,说明GhADF7在花药中特异表达。同时还进行了GhADF8的Northern杂交,没有任何表达信号显示,可能是GhADF8的表达量很低,Northern杂交检测不到而已。 3.序列分析 按所分离的棉花肌动蛋白解聚合因子(actin-depolymerizing factor,ADF)cDNA序列合成特异引物,以陆地棉(Gossypium hirsutum)叶片DNA为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增分离获得棉花GhADF7基因。利用DNAStar对该基因的序列进行分析表明:GhADF7基因编码区含有3个外显子和2个内含子,且内含子位置是高度保守的。 利用生物信息学等技术方法对GhADF2,GhADF7和GhADF8三个基因编码的氨基酸序列及来源于拟南芥的AtADF3和AtADF4的氨基酸序列进行结构同源性和