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银鲫和彩鲫hira基因的克隆及表达分析

杜新征  
【摘要】:Hir/hira(histonc regulation)基因是组蛋白基因表达的负调节因子,其产物包含一组保守的蛋白家族,广泛存在于从酵母、果蝇、鱼、爪蟾、鸡以及到哺乳动物小鼠和人类等多种生物体当中。本研究通过PCR和RACE的方法,分别从天然雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫成熟卵细胞的SMART cDNA文库中克隆出hira全长基因。通过与其它已知的HIRA家族基因比对,同源性非常高,证明所获得的新全长基因为HIRA家族成员。从银鲫中新克隆的基因被命名为Carassius auratus gibelio hira(Caghira),从彩鲫中新克隆的基因被命名为Carassius auratus hira(Cahira)。其中Caghira基因全长3828bp,含有一个3033bp的开放阅读框,编码一个由1011个氨基酸残基组成的蛋白质;Cahira基因全长3722bp,开放阅读框位于187~3220bp之间,编码1011个氨基酸。两者的氨基酸序列均具有7个WD结构域,且具有高度的同源性,同源性高达99%。HIRA蛋白家族在N端的7个WD重复区,推测形成一个β螺旋结构,该β螺旋结构可能与蛋白质—蛋白质互作有关。CagHIRA和CaHIRA的N端同样具有7个WD结构域,由于含有WD结构域的蛋白具有调节信号传递和mRNA前体加工的功能,可以推测银鲫和彩鲫HIRA蛋白可能同样具有调节组蛋白基因表达的作用。 采用RT-PCR方法并结合整体原位杂交的方法分析了银鲫Caghira在不同组织中和胚胎发育不同阶段中的表达特征。成鱼组织中,Caghira在卵巢和脑中均有表达,但脑中表达量较弱,说明该基因在维持卵巢和脑组织作用中起一定作用。在银鲫的未受精卵中和胚胎发育不同阶段均可以检测到少量的转录产物,表达量未检测到明显变化,表明hira基因可能在银鲫雌核发育过程中发挥一定作用。胚胎原位杂交显示,Hira基因的转录本在银鲫胚胎早期广泛分布,而在胚胎后期主要集中于头部、心脏及尾芽尖部,说明也对其脑部和心脏的发育有影响。本论文同时采用RT-PCR方法分析了彩鲫Cahira在不同组织中和胚胎发育不同阶段中的表达特征。成鱼组织中,Cahira在卵巢、脑、心、肝、脾、肾中均有表达,在卵巢和肝脏中表达较强,而在精巢和肌肉中不表达,表明它可能在卵巢发育和卵子发生过程中发挥一定作用。在彩鲫中,从未受精卵到胚胎发育的各个时期均可检测到表达,但表达量发生明显变化,受精后表达量迅速下降,直到原肠胚期表达量有所上升,并一直保持到出苗。hira基因在两亲缘种成熟卵子受精前后表达情况不同,可能与两种鱼不同的生殖方式有关。在果蝇中的研究已经表明hira基因与精核解凝形成雄性原核有关。由于彩鲫是两性生殖方式鱼类,在受精前hira基因大量表达,可能为受精时


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