海南特色动物cDNA文库构建及文库筛选

【摘要】： 运用SMART(Switching Mechanism at 5'end of RNA Transcript)技术,构建了海南坡鹿、海南黄牛、五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库。用RNAiso Reagent(TAKARA)处理新鲜血液,以总RNA抽提试剂盒(上海华舜)制备总RNA。用Powerscript~(TM)反转录酶逆转录合成第一链cDNA,LD-PCR扩增获得cDNA双链,SfiⅠ酶切和CHROMA SPIN-400~(TM)柱分离后,500bp以上的片段与pDNR-LIB载体连接,电转化入E.coli.DH5α,建成原始文库。然后,扩增文库并随机挑取单菌落,鉴定重组子插入片段大小。经鉴定,海南坡鹿、海南黄牛、五指山小型猪库容量分别达到1.9×10~6、1.2×10~6、1.5×10~6,原始文库滴度分别为1.59×10~(10)cfu/mL、3×10~9cfu/mL、9.7×10~9cfu/mL,扩增后的文库滴度分别为7.4×10~(12)cfu/mL、4.3×10~(10)cfu/mL、6.4×10~(10)cfu/mL。重组率接近100%,插入片段大小为0.5-2kb,平均长度约为1.0kb。构建的三种外周血白细胞cDNA文库符合建库要求,可以用于全长cDNA的筛选。为海南特色动物新基因的获得及结构和功能研究提供了可靠材料。 对海南五指山小型猪蛋白酶体亚基α型6(proteasome subunit alpha type 6,PMSA6)cDNA基因进行克隆和生物信息学分析:以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法,克隆得到PMSA6全长cDNA,并运用生物信息学软件对该基因核苷酸序列进行分析和预测其编码蛋白的理化性质及二级结构等。生物信息学分析表明:该cDNA全长1029 bp,5'非翻译区长97 bp,3'非翻译区长192 bp,含有一个741 bp完整的开放阅读框,编码246个氨基酸。该蛋白的分子量为37.680 kDa,等电点为8.76。进一步比对分析发现,五指山小型猪PMSA6基因的核酸序列及其氨基酸序列与人、牛等哺乳动物具有很高的相似性。PMSA6基因广泛的存在于动物界,其结构和功能具有高度的保守性。