收藏本站
收藏 | 论文排版

一种来源于Enterobacter sp.CGMCC2487菌株的木糖苷酶基因的克隆、异源表达及产物的生化特性研究

向海波  
【摘要】:紫杉醇为红豆杉植物的次生代谢产物,对卵巢癌、乳腺癌等癌症有很好的治疗作用。目前人们主要从红豆杉的树皮和枝叶中提取紫杉醇。在红豆杉中,紫杉醇的干重仅为0.02%,而7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的含量则是紫杉醇的10倍以上,但都作为废物而丢弃。7-木糖-10-去乙酰紫杉醇去掉C-7位木糖基即转变为10-去乙酰紫杉醇,再通过一步酰化反应即可生成紫杉醇。因此,利用好这一资源具有广阔的前景。 前期实验我们从东北红豆杉中筛选到一株能将7-木糖-10-去乙酰紫杉醇高效水解为10-去乙酰紫杉醇的微生物-Enterobacter sp. CGMCC2487。本实验将用构建基因组文库的方法筛选出Enterobacter sp. CGMCC2487木糖苷酶基因,把筛选到的基因连接到pET-23a载体和pHBM905A载体上,分别转化大肠杆菌和毕赤酵母进行表达。然后用High-Affinity Ni-NTA Resin纯化表达的木糖苷酶,以4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(pNPX)为底物测定木糖苷酶的酶学性质,包括木糖苷酶的酶活、最适温度及温度稳定性、pH及pH稳定性,木糖对酶活的影响,金属离子等一些试剂对酶活的影响等。最后进行7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的水解实验,薄层色谱检测水解产物,研究水解效率。 通过构建基因组文库,我们筛选到一个木糖苷酶基因,其开放阅读框长1680bp,编码559个氨基酸,编码的木糖苷酶分子量为63.2KDa,等电点为4.90。将该基因重组到E.coli BL21菌株中表达,得到的重组酶的最适pH为6.2,在pH5.0-8.0之间保持稳定。最适温度为50℃,在45-50℃之间保持稳定,酶活力半衰期为1h时的温度T1/2为50℃。该重组酶特异酶活、Km和Vmax分别为618.5mU/mg、2.43±0.0583mmol/L和20.17±0.4834μmol/(min-mg)。该重组酶对木糖比较敏感(抑制常数Ki=24.04mmol/L),其酶活受PMSF,Co2+, Fe3+,Cu2+,Hg2+和Zn2+,SDS的抑制,但2mmol/L的Fe2+能显著提高该酶的酶活,使酶活达到原来的164%。根据该酶对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的水解实验发现该酶不能将7-木糖-10-去乙酰紫杉醇水解为10-去乙酰紫杉醇,推测存在着另外一个能水解7位木糖基的木糖苷酶,目前正在克隆中。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前15条
1 丁毅力,刘育亭;糖苷端差异构体的波谱研究 Ⅲ.全乙酰化芳基1-硫代-α和β糖苷的FT-IR[J];光谱学与光谱分析;1988年04期
2 张建国,王铎,张国栋,孙昌俊,戚聿新;2-取代-5-氟脲嘧啶的_β-D -木糖苷的合成(英文)[J];青岛海洋大学学报(自然科学版);1999年S1期
3 吴华伟,戴军,邵蔚蓝;草菇中木糖苷酶的分离纯化及其酶学性质[J];食品与生物技术;2004年03期
4 薛业敏,卢晨,毛忠贵,邵蔚蓝;阿拉伯糖苷酶基因的克隆、表达及表达产物的酶稳定性[J];中国农业大学学报;2003年05期
5 王跃虎;张仲凯;何红平;高锁;孔宁川;丁铭;郝小江;;白粉藤的木脂素和三萜成分(英文)[J];云南植物研究;2006年04期
6 姜禹;金永日;张昌壮;殷宗元;李绪文;王皓南;;京大戟的化学成分[J];吉林大学学报(理学版);2010年05期
7 陈惠忠;高培基;王祖农;;产木聚糖酶菌株的选育及其液体发酵条件[J];微生物学报;1990年05期
8 洪枫,余世袁,陈牧;调控pH值提高木聚糖酶活力的研究[J];南京林业大学学报;1999年05期
9 谢海辉;徐新亚;丹阳;魏孝义;;污叉丝孔菌菌丝体培养物中烷基苷类化合物(英文)[J];中国天然药物;2009年05期
10 杨瑞金,许时婴,王璋;具有高木二糖形成活力的木聚糖酶生产菌株的筛选与产酶培养基的优化[J];工业微生物;2001年01期
11 薛业敏,邵蔚蓝,毛忠贵;微生物木聚糖降解酶系统[J];生物技术;2003年01期
12 陈红歌,朱静,梁改芹,严自正,张树政;酸性木聚糖酶产生菌的筛选及产酶条件[J];微生物学报;1999年04期
13 范美霞;孙迅;陶宗娅;;木聚糖酶的研究进展[J];菏泽学院学报;2009年02期
14 张春枝,王振宇,陈莉,金凤燮;高温厌氧菌分解纤维素的研究[J];大连轻工业学院学报;1998年03期
15 毛连山,宋向阳,勇强,姚春才,余世袁;初始pH对合成木聚糖酶和纤维素酶的影响[J];南京林业大学学报(自然科学版);2002年04期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 袁经权;周小雷;王硕;柯昌强;杨新洲;缪剑华;;八角茴香黄酮苷成分研究[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 但春;丁香和升麻的化学成分研究[D];中国科学院研究生院(成都生物研究所);2006年
2 范云双;绿升麻生物活性成分的研究[D];天津大学;2007年
3 高璟春;类叶升麻的药用亲缘学意义研究[D];中国协和医科大学;2007年
4 韦柳斌;青天葵及翻白叶树根化学成分研究[D];暨南大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 杨芯卓;嗜热微生物来源的葡萄糖苷酶和木糖苷酶性质及功能研究[D];中国农业科学院;2014年
2 刘美华;染料木素木糖苷的合成及其生物活性研究[D];南昌大学;2007年
3 郭宝凤;25-乙酰基-7,8二去氢—升麻醇-3-木糖苷对HepG2的细胞毒性及其作用机制初探[D];北京中医药大学;2011年
4 李晓;两种药用植物的化学成分研究[D];河南大学;2008年
5 江小华;里氏木霉木聚糖酶的分离纯化、酶学特性及降解机理的研究[D];南京林业大学;2006年
6 刘梦韩;葛枣猕猴桃化学成分的研究[D];吉林大学;2009年
7 管惠娟;铁皮石斛的化学成分及指纹图谱研究[D];沈阳药科大学;2009年
8 许周典;青皮竹Bambusa textilis McClure竹叶化学成分及其抗真菌活性研究[D];安徽农业大学;2013年
9 祖灵博;黄花败酱化学成分的研究[D];安徽大学;2013年
10 史国茹;岩五加生物活性化学成分研究[D];天津医科大学;2012年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978