一种来源于Enterobacter sp.CGMCC2487菌株的木糖苷酶基因的克隆、异源表达及产物的生化特性研究

【摘要】：紫杉醇为红豆杉植物的次生代谢产物,对卵巢癌、乳腺癌等癌症有很好的治疗作用。目前人们主要从红豆杉的树皮和枝叶中提取紫杉醇。在红豆杉中,紫杉醇的干重仅为0.02%,而7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的含量则是紫杉醇的10倍以上,但都作为废物而丢弃。7-木糖-10-去乙酰紫杉醇去掉C-7位木糖基即转变为10-去乙酰紫杉醇,再通过一步酰化反应即可生成紫杉醇。因此,利用好这一资源具有广阔的前景。 前期实验我们从东北红豆杉中筛选到一株能将7-木糖-10-去乙酰紫杉醇高效水解为10-去乙酰紫杉醇的微生物-Enterobacter sp. CGMCC2487。本实验将用构建基因组文库的方法筛选出Enterobacter sp. CGMCC2487木糖苷酶基因,把筛选到的基因连接到pET-23a载体和pHBM905A载体上,分别转化大肠杆菌和毕赤酵母进行表达。然后用High-Affinity Ni-NTA Resin纯化表达的木糖苷酶,以4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(pNPX)为底物测定木糖苷酶的酶学性质,包括木糖苷酶的酶活、最适温度及温度稳定性、pH及pH稳定性,木糖对酶活的影响,金属离子等一些试剂对酶活的影响等。最后进行7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的水解实验,薄层色谱检测水解产物,研究水解效率。 通过构建基因组文库,我们筛选到一个木糖苷酶基因,其开放阅读框长1680bp,编码559个氨基酸,编码的木糖苷酶分子量为63.2KDa,等电点为4.90。将该基因重组到E.coli BL21菌株中表达,得到的重组酶的最适pH为6.2,在pH5.0-8.0之间保持稳定。最适温度为50℃,在45-50℃之间保持稳定,酶活力半衰期为1h时的温度T1/2为50℃。该重组酶特异酶活、Km和Vmax分别为618.5mU/mg、2.43±0.0583mmol/L和20.17±0.4834μmol/(min-mg)。该重组酶对木糖比较敏感(抑制常数Ki=24.04mmol/L),其酶活受PMSF,Co2+, Fe3+,Cu2+,Hg2+和Zn2+,SDS的抑制,但2mmol/L的Fe2+能显著提高该酶的酶活,使酶活达到原来的164%。根据该酶对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的水解实验发现该酶不能将7-木糖-10-去乙酰紫杉醇水解为10-去乙酰紫杉醇,推测存在着另外一个能水解7位木糖基的木糖苷酶,目前正在克隆中。