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C5aR介导LPS诱导的肾脓毒血症以及肾I/R损伤机制的研究

张泽英  
【摘要】:在动物和人的机体中存在一种与免疫应答相关的生物活性成分即补体,其具有酶特有的生物活性,主要存在于血清或细胞膜表面。某些免疫激活物可激活补体系统,并且产生大量具有如过敏毒素C3a、C4a、C5a等生物活性的片段。研究表明目前最强的过敏毒素是C5a,它是激活物激活补体后发生级联反应由C5转化酶裂解补体C5产生的片段,C5a在机体中发挥各种生理功能主要是通过结合在C5a受体(component 5a receptor,C5aR)上形成C5a/C5aR复合物来实现的。C5a受体又称CD88(Cluster of Differentiation 88,CD88),是目前研究较为清楚的一种与补体C5a相结合的G蛋白偶联受体,表达于多种细胞膜上,是重要的炎症反应递质和趋化因子,对急性炎症反应的发生、发展起着重要作用。研究表明,在人和动物的肾脏组织中广泛存在C5aR的表达,在肾脏病理过程中起着关键作用,当肾脏受到损伤后,C5aR可能诱导单核细胞释放TNF-α(Tumor Necrosis Factor)、IL-6(interleukin-6)和IL-8(interleukin-8)等促炎因子。C5aR是否介导了脓毒血症等急性肾损伤和肾缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)还不是很清楚。本研究构建了靶向大鼠C5aR基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体,通过脂质体2000转染大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E细胞系,通过尾静脉高压注入大鼠体内,采用荧光定量PCR法、蛋白质印迹法(Western blot法)、酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA法)、流式细胞术等方法检测各组细胞和动物体内C5aR表达情况,细胞凋亡率,细胞和动物体内相关细胞因子的表达,以及大鼠肾功能状况,探讨短发夹RNA(shRNA)阻断大鼠肾小管上皮细胞补体受体C5aR基因表达对抑制LPS诱导的肾脏脓毒血症的影响。采用C5a和C5aR拮抗剂刺激大鼠肾小管上皮细胞,通过流式细胞术测定细胞凋亡,ELISA法检测上清液中炎症因子TNF-α和IL-6的浓度,采用免疫荧光法检测细胞内NFAT核转位的变化,CCK-8法检测细胞活性,探讨C5aR在肾脏缺血再灌注损伤过程中释放炎性因子的作用及其机制,明确C5aR拮抗剂对上述病变过程的干预作用。这些研究证明,C5aR是肾上皮细胞损伤的重要因素,病理条件下,阻断C5aR可预防肾脏损伤。通过对C5aR对肾脓毒血症和肾缺血再灌注损伤中作用机制的深入研究,为我们进一步研究相关肾脓毒血症和肾缺血再灌注损伤的发病机制提供了研究基础;同时也为肾脓毒血症和肾缺血再灌注损伤的预防和治疗等提供了新的治疗靶点和新的干预措施。通过干扰C5aR的表达可望成为肾脏疾病预防和治疗的新手段。


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