大肠杆菌来源的漆酶CueO在毕赤酵母GS115中的高效表达及在染料脱色中的应用研究

【摘要】：漆酶(EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,催化过程中伴随单电子的转移并且将分子氧还原成水。漆酶来源广泛,如真菌(尤其是白腐真菌)、植物、昆虫和细菌等都有发现。由于漆酶催化的底物比较广泛,可以达到250种左右,能催化芳香族化合物的交联,降解聚合物和切割芳香族化合物的环,因此被广泛应用于纺织废水的脱色,造纸工业的纸浆漂白。同时漆酶还能够降解多种酚类化合物和固醇类激素,因此可以用于生活污水的处理。在纺织行业、造纸行业、环境保护等领域中有重要的应用前景。目前研究发现天然漆酶生产周期长、产量低,因此筛选得到高表达量、高活性的重组漆酶菌株一直是研究的焦点。大肠杆菌K12菌株中组成型漆酶yacK基因序列号:P36649,其编码基因序列长为1470 bp,编码490个氨基酸。通过设计引物扩增目的基因,并克隆到带有d1+2×201 AOX1启动子和MF4I-SS信号肽pHBM905BDM的表达质粒,以电转化方式导入毕赤酵母GS115宿主菌。利用漆酶底物2,6-二甲基苯酚平板显色法筛选出阳性重组酵母菌株。在5 L发酵罐高密度发酵时最高蛋白表达量可达到556 mg/L,总酶活达到41,000 U/L。CueO漆酶酶学性质表明:以ABTS为底物最适反应温度与最适反应pH值分别为55°C和3.0,CueO漆酶有较高的pH耐受性,在pH 3.0-8.0范围内酶活保持在80%以上。CueO漆酶有较高热稳定性,在70℃时半衰期约为60 min。为了进一步研究CueO漆酶的脱色应用,选取三种不同结构染料(偶氮类、三苯甲烷类和蒽醌类)进行了脱色实验,实验结果表明以乙酰丁香酮作为介质的条件下对刚果红、孔雀绿脱色率分别是98.1%和98.5%;无需介质时染料RB亮蓝脱色效率达到90.03%。以上实验结果表明,重组漆酶CueO在染料脱色中有着比较好的应用前景。