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19种木兰科植物过氧化物酶研究

赵广华  
【摘要】:木兰科植物是被子植物中较原始的类群,而中国丰富的木兰科植物种类,为研究被子植物的起源及系统发育提供了珍贵材料。木兰科植物POD同工酶由保守的多基因编码表达,被作为一种分子标记,能够反映物种在进化过程中产生的变异。本课题采用乳酸铝酸性电泳、POD同工酶谱技术以及聚类分析方法,研究了19种木兰科植物叶POD同工酶谱间的差异,为木兰科植物多样性研究及亲缘关系鉴定提供了更多的技术支持。同时,在研究木兰科植物POD同工酶多样性的过程中,发现大多数木兰科植物叶中具有很高的POD活性。本文进一步对对恩施地区常见的木兰科植物——深山含笑的叶POD进行分离纯化,研究其部分酶学性质;并对其清除有机污染物BPA的特性进行了探讨;为提高深山含笑叶POD的利用效率,采用Fe_3O_4-海藻酸钠吸附交联法对其进行固定化。为本地区木兰科植物资源的综合应用提供理论和技术上的支持。研究结果如下:(1)通过乳酸铝酸性电泳,成功将木兰科植物叶中POD同工酶进行分离,而常规碱性活性电泳及乙酸钾酸性电泳无法有效分离木兰科植物叶POD。聚类分析结果显示,19种木兰科植物被聚为4类,与1996版《中国植物志》第30(1)卷中的分类基本一致,这表明该电泳分离及聚类分析方法能够用于木兰科植物叶POD同工酶的多样性研究中。(2)经过缓冲液抽提、ATPE除色、DEAE-Sepharose FF离子交换层析等,BPOD的纯化倍数达到5.5倍,相对SPOD纯化倍数为55.2倍,酶的活性回收率达19%。其酶学性质研究结果显示,该酶的最适反应温度为50℃,能够稳定的保存在温度低于50℃的缓冲液中,具有良好的热稳定性;其最适反应pH值为4.5,在pH 5.5~9.5范围内保存12 h,酶活力下降不明显;说明该酶具有较好的酸碱稳定性。(3)深山含笑叶POD清除BPA的研究结果显示,深山含笑叶POD在pH4~7,温度30~40℃,H_2O_2/BPA摩尔浓度之比达0.8的条件下,对BPA清除率达90%以上。相对于HRP、TP以及SBP等POD,在清除BPA方面,深山含笑叶POD具有更宽的pH、温度适应范围以及更高的清除率;显示了深山含笑叶POD应用于EDCs污染治理的巨大潜力。(4)对深山含笑叶POD的固定化研究结果显示,采用Fe_3O_4—海藻酸钠吸附交联法比海藻酸钠包埋法具有更高的酶固定化率,能提高14.2%的酶固定化率。对Fe_3O_4—海藻酸钠吸附交联法得到的固定化酶的部分性质的研究结果显示,可能由于Fe_3O_4的加入,该方法制备的固定化酶能够在常温甚至低温条件下保持相对较高的酶活性。而其最适反应pH值较游离酶下降1.0,使其能够适应更宽的酸性pH范围。当固定化酶循环使用5次后,酶活力降低为原来的55%,说明该固定化酶具有重复利用的特性,具有较好的操作稳定性。


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