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嗜热真菌木聚糖酶1YNA的表达、突变和酶特性研究

付正  
【摘要】:木聚糖酶能将木聚糖降解为低聚木糖和少量木糖。在饲料、食品和造纸行业等都有极大地应用前景。现在商业应用的木聚糖酶大部分都是通过工程菌大规模发酵得到的。到目前为止,来源于不同生物的多种木聚糖酶已经被成功表达于大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母和真菌等宿主。嗜热真菌DSM10635所分泌的木聚糖酶属于糖苷水解酶第11家族,其等电点为3.7,最适pH是6.5,最适温度是70℃,在pH 5.5-9.0下都具有很高的酶活性。 本论文通过简并引物对嗜热真菌DSM10635的总DNA进行PCR,从而获得木聚糖酶的基因,序列比对后发现此木聚糖酶基因含有一个内含子,采用重叠延伸PCR技术除去内含子后,即得到木聚糖酶的编码序列。将编码序列与表达载体pET-22b(+)的重组质粒转化表达宿主BL21(DE3),诱导表达得到有生物活性的木聚糖酶。酶特性分析的结果表明原核表达的木聚糖酶的最适温度为65℃,比嗜热真菌DSM10635分泌的木聚糖酶的最适温度低了一些。其热稳定性也要差一些。 实验中我们对木聚糖酶基因进行了一些突变并将突变后的木聚糖酶基因表达于大肠杆菌。通过突变引物利用PCR技术将突变引入到木聚糖酶基因中。所有的突变木聚糖酶都成功的表达于大肠杆菌。突变酶酶特性分析的实验结果表明突变酶发生了一些变化。N-端单个氨基酸的突变对木聚糖酶的性质影响不大,但是加入二硫键后的木聚糖酶的性质有了明显的变化。加入二硫键后的木聚糖酶(如DSB1)的最适温度为75℃,比未突变的1YNA增加了10℃。热稳定性也有了极大的改善。在80℃处理30min后还保留有40%左右的相对残余酶活力。 本文还对木聚糖酶1YNA和DSB2进行了纯化。通过硫酸铵沉淀、疏水作用层析、离子交换层析和超滤浓缩后,1YNA和DSB2的比活力分别达到5912IU/mg蛋白、6756IU/mg蛋白。纯化后的木聚糖酶为进一步的研究奠定了基础。


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