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谷氨酰胺转胺酶基因的定点突变及其酶学性质研究

代风娇  
【摘要】:蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰胺转胺酶(EC2.3.2.13),即谷氨酰胺转胺酶(简称TGase、TG),它能催化谷氨酰胺转胺酶中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基发生转移,促使蛋白分子内部及分子间的发生交联,可改善蛋白结构,提高物质的弹性,保持蛋白的营养,在食品、医药、化妆品等领域具有非常高的实用价值。谷氨酰胺转胺酶的来源广泛,动物来源的TG需要Ca2+来暴露其活性区的半胱氨酸残基位点,且获取工艺较为复杂昂贵,相较之下,微生物来源的TG(Microbial transglutaminase,简称MTG)来源广泛,生产周期短,不依赖Ca2+,酶的热稳定性更高、催化能力更强,更适合工业生产。本文是笔者对实验室保存的一株从土壤中分离得到的吸水链霉菌H197菌株的TG基因序列的分析,编码区基因大小为1257bp,编码417个氨基酸,GC含量为61.4%,分子量约为46.6kDa,pI为7.08。根据其三维空间结构的特征,设计突变位点,将酶活中心三联体Cys151-Asp342-His361中361位His(CAC)突变成Lys(AAA)。设计突变引物,以重组质粒pET-22b(+)-MTG为模板,利用重叠延伸PCR技术定点突变,构建含突变位点的突变重组质粒pET-22b(+)-MTG-M,并转化E.coli BL21(DE3)。菌落PCR及酶切验证后测序,结果显示:第1090位的C突变成A,第1092位的C突变成A,即His(CAC)成功突变成Lys(AAA)。获得两株重组菌株,即突变型pET-22b(+)-MTG-M-E.coli BL21(DE3)(命名为p-B-M-M)和野生型pET-22b(+)-MTG-E.coli BL21(DE3)(命名为p-B-M)。对两种重组菌进行IPTG诱导小量表达,测定蛋白浓度及粗酶活。突变型蛋白浓度为7.69 g/L,粗酶活力为0.437U/m L,野生型蛋白浓度为7.93 g/L,粗酶活力为0.425U/mL,两者酶活没有显著性差异(T检验P0.05)。表明His位点的改变并不影响MTG蛋白的表达力和酶的催化活力。从诱导条件来看,8-12h是诱导表达的最佳时间,诱导时间过长反而不利于MTG蛋白的表达;当IPTG浓度为0.8g/L时,MTG表达量最大,过高的IPTG浓度对MTG蛋白的表达反而有着一定的抑制作用;30℃时,MTG蛋白的表达达到最大值。通过镍柱对诱导表达的蛋白进行亲和层析纯化,野生型菌株比活力由纯化前的0.056U/mg升到3.28U/mg,突变型菌株比活力由纯化前的0.053U/mg变为3.38U/mg,纯化倍数达到近60倍。野生型蛋白酶液可在pH5-9的范围内保持稳定,而突变型的稳定只能维系在pH为6-8范围内,两者均在pH为7.0时酶活最稳定;MTG酶液在20℃-40℃保温30min时,其酶活力损失较小,而在高于50℃保温30min会失去几乎所有的活性,说明其热稳定不高,相较于野生型,突变体酶的热稳定性更差;除Ni+和Cu2+对酶活力有较大抑制,其它供试金属离子对MTG酶活力抑制均较小。与野生型相比,突变型酶的酶活力无改变,但是它的热稳定性、pH稳定性及对金属离子的稳定性都有所降低,可见酶活性中心Cys151-Asp342-His361的361位的His虽然不是酶活性中心三联体中发挥催化作用必须的氨基酸,但该位点改变会影响酶的稳定性。因此,361位的His位点的存在能保持酶活性中心稳定性,保证催化过程顺利进行。


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