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具抑菌活性放线菌JMC 06001的鉴定和次生代谢产物初步研究

贺建武  
【摘要】:从海洋微生物中提取药物及其先导化合物是目前世界新药研发的前沿领域之一。本课题组从中国南海硇洲岛高盐环境中分离到一株放线菌JMC06001,初步研究表明,该菌株的发酵液具有较强的抗菌活性。本研究对该菌进行分类学鉴定,用八种抑菌指示菌对发酵液和菌丝体抽提物进行抗菌活性筛选,用响应面法对发酵培养基进行优化,并对该菌的次生代谢产物进行了初步分离纯化和理化稳定性研究。 研究表明,菌株JMC06001在多数培养基上生长良好,气生菌丝白色,基内菌丝淡黄色至浅棕色。在燕麦琼脂(ISP3)、甘油-天门冬酰胺琼脂(ISP5)、葡萄糖-天门冬酰胺琼脂(glucose/asparagines agar)及马铃薯浸汁琼脂(potato extract agar)上产生黄色可溶性色素,在酵母膏-麦芽膏琼脂(ISP2)、蛋白胨酵母膏铁盐琼脂(ISP6)和营养琼脂上产生棕色可溶性色素。生长温度范围为4℃-40℃,最适生长温度28℃。生长pH范围为6.0-9.0,最适pH7.0。能在含0~1.5mol/L NaCl的培养基上生长,最适生长盐浓度为0.2~0.5mol/L NaCl。根据其形态学特征、生理生化特征、细胞化学分类特征和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析结果,菌株JMC06001被鉴定为链霉菌属(Streptomyces)的有效发表种波赛链霉菌(Speucetius)的一个菌株(S. peucetius JMC06001)。 使用了藤黄八叠球菌(Sarcina lutea CGMCC1.880)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC6051).大肠杆菌(Escherichia coli ATCC128)、黑曲霉(Asperillus niger NCPC1003).产气肠杆菌(Enterobacter aero genes ATCC8724)。变形杆菌(Proteus vulgar is ATCC8427)、白色念珠菌(Candida albicans NCPC1027)、青霉(Penicillium. sp. ATCC12556)、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa ATCC27853)9种指示菌,采用杯碟法,研究了S. peucetius JMC06001菌株的发酵液和菌丝体中活性物质的抑菌谱,并对由该菌产生的抑菌物质对温度、酸碱度、抗紫外线的稳定性进行了考察。结果表明,该菌对指示菌株中部分革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌有明显的抑制作用。稳定性试验结果显示,该菌产生的抑菌活性物质的最适温度为40℃,最佳pH值在7.0左右,具有较好的热稳定性和较宽的酸碱耐受范围,抗紫外线辐射能力强。 本研究还对S. peucetius JMC06001发酵液中次生代谢产物进行了初步的分离纯化研究,通过薄层指导跟踪和抑菌活性跟踪对发酵液的乙酸乙酯萃取物浸膏进行了分离和纯化。经柱层析收集了386份馏分,通过薄层层析跟踪和抑菌活性跟踪,合并相同斑点且具有抑菌活性的馏分,得到了9个主要的组分,分别命名为JMH01~JMH09,组分中主要代谢产物的纯度经高效液相色谱仪进行了初步的检测,可为该菌的产业化应用提供可靠的工艺参数。 采用响应面优化了S. peucetius JMC06001发酵培养基,得出该培养基的最佳组合为:葡萄糖12g,麦芽糖7g,蛋白胨9g,大豆粉14g, NaC137g, CaCO31g,复合盐A液20mL,复合盐B液1mL,起始pH值7.0。在优化后的培养基中,对藤黄八叠球菌的抑菌圈直径为31.50mm,实际与预测值的相对偏差仅为1.71%,比基础培养基对藤黄八叠球菌的抑菌圈直径26.52mm提高了18.8%。


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