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湘西蛇足石杉石杉碱含量及石杉碱甲生物合成LDC基因的克隆与功能表征

杜次  
【摘要】:蛇足石杉[Huperzia serrata(Thunb) Trev.]属于石杉科(Huperiaceae),石杉属(HuperziaBernh)植物,是我国传统中草药,也是目前石杉碱甲的主要药源植物。湘西蛇足石杉资源优质丰富,但缺乏系统性研究。本研究以湘西蛇足石杉为实验材料,研究内容如下: (1)采用超声萃取法提取蛇足石杉总生物碱,利用高效液相色谱(HPLC)法同时测定其石杉碱甲、乙和丙含量,并分析其在植株不同部位的分布。湘西3个样地蛇足石杉中石杉碱甲、乙和丙含量基本一致,分别达到0.5‰、0.3‰和0.04‰;但植株不同部位三种石杉碱含量差异显著,其中石杉碱甲和乙的分布均为叶茎根,石杉碱丙则是根大于叶和茎。由此可知,湘西蛇足石杉具有资源优势,石杉碱在植株的分布具有明显的部位选择性;采用HPLC可同时检测石杉碱甲、乙和丙,方法简单快速、准确可靠。 (2)采用RT-PCR法从蛇足石杉幼嫩叶片中分离赖氨酸脱羧酶基因(LDC),通过TA连接法对该基因进行克隆以及测序和生物信息学分析。获得2个蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因,分别命名为LDC1和LDC2,两基因开放阅读框(ORF)分别为636bp和606bp,GenBank序列注册号为JQ308624.1和JQ308625.1;预测可编码蛋白序列212aa和202aa,同源比对表明均属于赖氨酸脱羧酶家族,蛋白信息学分析发现两基因编码蛋白理化性质和三维结构基本相同。 (3)构建重组质粒pET-32a(+)-LDC1和pET-32a(+)-LDC2,选用大肠杆菌BL21作为表达宿主,对LDC1和LDC2进行外源重组表达,采用Ni-NTA柱亲和层析分离纯化目标蛋白,利用薄层层析(TLC)对原核表达产物活性进行分析。成功构建了可溶性表达的重组菌株,获得Trx-LDC1和Trx-LDC2重组蛋白,活性分析表明LDC1和LDC2均可催化赖氨酸脱羧形成尸胺。实验结果表明LDC1和LDC2均具有赖氨酸脱羧酶活性,也证明LDC1和LDC2为蛇足石杉生物合成石杉碱甲中的赖氨酸脱羧酶基因。 (4)采用HPLC测定蛇足石杉根、茎、叶中石杉碱甲含量,以肌动蛋白基因为内参物,通过半定量RT-PCR比较LDC在根、茎、叶中的表达量,分析石杉碱甲分布与LDC表达量的关系。结果表明蛇足石杉根、茎和叶中石杉碱甲含量分别为(0.201±0.008)‰、(0.455±0.002)‰和(0.579±0.009)‰,差异显著,LDC在不同部位表达量无明显差异,推测赖氨酸脱羧酶不是石杉碱甲生物合成中的关键酶。


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