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硫化氢对急性病毒性心肌炎心肌损伤的保护作用及机制研究

杨翠平  
【摘要】:背景:病毒性心肌炎(VMC)是因病毒感染和自身免疫反应共同引起的心脏局灶性或弥漫性炎症病变的一种急性或慢性心肌炎性疾病。引起病毒性心肌炎的病毒已知有肠病毒、腺病毒、流感病毒等20多种病毒,肠病毒的柯萨奇病毒3(Coxsackievirus B,CVB)最为常见,约占50%[1]。病程可呈急性或慢性,大多数可痊愈,约15%的患者由于急性期病情反复发展为扩张型心肌病(DMC)。临床上在新生儿、小儿突发死亡病例中20%因CVB3诱导的VCM所致,死亡率逐年攀升[2],对小儿和青少年的健康和生命带来极大威胁。CVB3引起的心肌炎症损伤,进而发展为扩张型心肌病甚至心力衰竭的病理过程的具体机制还不十分清楚,但越来越多的实验研究表明,心肌细胞凋亡是病毒性心肌炎发生发展的重要机制之一[3],通过干预凋亡基因的表达阻断心肌细胞凋亡过程以起到保护心肌的方法备受人们关注,P53作为一个高效的凋亡启动因子,在细胞凋亡过程中起着十分重要的调控作用,通过P53泛素化通路对心肌细胞凋亡的调控,可能是治疗VMC的重要靶点。硫化氢(H2S)作为继一氧化氮和一氧化碳之后第三种气体信号分子近年来备受关注,国内外研究者发现,在大量心肌疾病动物模型研究中被证实硫化氢能通过抑制炎症反应,调控心肌细胞凋亡相关基因及蛋白的表达,发挥出抗炎症、抗细胞凋亡的生物学效应[4]。在体内外实验研究证实在CVB3所致对VMC模型中,外源性硫化氢(Na HS)可通过多个环节影响病毒性心肌炎的发展,发挥着减少自由基损害及抑制炎症反应的作用。在大鼠缺血再灌注模型中还起到抑制心肌细胞凋亡,调控凋亡相关蛋白表达的作用,但对其抗VMC心肌细胞凋亡的作用及作用机制目前国内外研究报道甚少。目的:本实验研究Na HS对CVB3诱导的急性病毒性心肌炎Balb/c小鼠心肌的保护作用,及对心肌细胞凋亡相关蛋白P53、BAX/BCL 2表达的影响,并进一步探讨Na HS在VMC中调控心肌细胞凋亡及其抗凋亡的作用机制。方法:实验分两部分。第一部分,将50只4 5周龄近交系纯种雄性Balb/C小鼠随机分为N组(正常对照组,n=10)、C组(CVB3病毒对照组,n=20)、H组(Na HS治疗组,n=20),C、H组小鼠腹腔反复接种CVB3病毒,H病毒感染同时分别给予硫化氢,N组每天腹腔注射生理盐水,每日1次,共7天,建立急性病毒性心肌炎Balb/c小鼠模型,观察并记录硫化氢对小鼠一般情况及生存情况,根据各时间点小鼠生存数,绘制生存曲线进行生存分析;死亡小鼠无菌取出心脏称重,计算HM/BM,并通过HE染色观察各组小鼠心肌病理改变及病理积分,TUNEI法检测心肌细胞凋亡数、Westernblot法检测心肌凋亡相关蛋白P53、BAX/BCL 2的表达;第二部分实验将70只Balb/c小鼠随机分为4组,N组(正常对照组,n=10)、C组(CVB3病毒对照组,n=20)、H组(Na HS治疗组,n=20)、H+P组(Pifithrinα+Na HS,n=20),造模同前,H组处理同前,H+P组病毒感染同时予以P53抑制剂,每日1次,共7天,连续观察15天,并各组小鼠在病毒感染后的第3d、7d、10d、14d各组随机取3 4只称重处死,无菌取心脏称重,HE染色光镜下观察心肌病理改变,TUNEI法检测心肌细胞凋亡数,并用Westernblot法检测P53泛素化及相关调节因子MDM2/MDMX、COP1以及P53转录相关凋亡蛋白BCL 2、BAX、PUMA、Caspase 3蛋白表达,以进行数据相关研究。结果:1)实验过程中,N组小鼠体重增加,未出现死亡,心肌病理改变未见异常,与N组相比较,C组小鼠的体重明显下降,生存率降低,HM/BM比值增大,心肌病理积分明显增加,心肌细胞凋亡指数上升;H与C组相比较,H组小鼠的一般情况明显改善,生存率提高,HM/BM比值降低,心肌病理积分明显减少,心肌细胞凋亡指数下降。与N组比较,C组P53蛋白表达水平显著增加(p0.01),BCL 2表达明显下降,而BAX表达增强,Caspase 3活性明显增加;予以Na HS干预,H组P53蛋白水平表达较C组明显降低(p0.05),BAX蛋白表达明显降低,BCL 2蛋白表达明显高于C组,Caspase 3活性明显下降。2)与N组比较,C组心肌组织中P53及P53磷酸化蛋白、MDM2蛋白表达增加,PUMA、Caspase 3蛋白表达均明显增加,MDMX、COP1蛋白表达明显减少;给予Na HS干预治疗后,与C组比较,H组P53及P53磷酸化蛋白表达减少,MDM2蛋白表达下降,BAX、PUMA蛋白表达明显减少,MDMX、COP1、BCL 2蛋白表达增加(p0.05);但Na HS+P53抑制剂干预后,H+P组小鼠生存率,心肌病理改变、心肌细胞凋亡指数与C组相比,差异无显著性(p0.05);但与H组比较,H+P组P53及磷酸化P53、MDM2、BAX、PUMA蛋白表达升高,MDMX、COP1、BCL 2蛋白表达继续减少,Caspase3活性明显增加。结论:Na HS对CVB3诱导的Balb/c小鼠急性VMC模型心肌细胞凋亡有明显的保护作用,其作用机理可能是通过调控P53泛素化通路中P53泛素化及相关调节因子及P53转录相关凋亡蛋白的表达,抑制P53活性,上调抗凋亡蛋白BCL 2表达,下调凋亡蛋白BAX、PUMA、Caspase 3等蛋白表达,抑制心肌细胞凋亡,从而起到保护心肌的作用。


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