单分子水平上核酸适体构象变化及量子点的成像研究

【摘要】：单分子检测能实时监测单分子行为和分子间相互作用,可揭示集团平均掩饰下的静态不均一和动态波动等个体差异性,已在分子构象变化、生物分子相互作用和超灵敏检测等方面得到广泛应用。本文基于全内反射荧光显微术(TIRFM),在单分子和单颗粒水平上对核酸适体(aptamer)的构象变化以及量子点成像进行了研究,主要包括: 1.在单分子水平研究表面固定的核酸适体的构象变化。在三磷酸腺苷(ATP)核酸适体的5’端标记生物素和荧光基团四甲基罗丹明(Tetramethylrhodamine, TMR),3’端标记猝灭基团Dabcyl。利用生物素和亲和素相互作用,将ATP核酸适体固定在玻片表面。基于TIRFM考察了核酸适体分子在ATP或cDNA作用下的荧光强度变化。结果表明,无ATP和cDNA时,核酸适体分子荧光强度较弱,大多数处于闭环状态,少数处于无规则卷曲状态。在ATP作用下,无规卷曲状态的核酸适体分子变成闭环状态,荧光强度下降。在cDNA作用下,核酸适体分子变为双螺旋状态,荧光强度显著升高。而在cDNA和ATP同时存在下,随着ATP浓度的增加,核酸适体分子由双螺旋状态转变为闭环状态,荧光强度下降。本研究对发展基于核酸适体的生物传感器具有参考价值。 2.利用单分子成像发展了基于量子点标记核酸适体的高灵敏蛋白质检测方法。目标蛋白凝血酶有两个核酸适体,结合位点亦不相同。本文将其中一条核酸适体通过生物素和亲和素的相互作用固定在玻片表面,另一条标记有量子点或荧光染料TMR。凝血酶与固定在玻片上的核酸适体以及荧光标记的核酸适体形成“三明治”结构,通过TIRFM测定荧光信号。结果表明,以量子点为荧光标记,凝血酶检测的线性范围为0.1 pM到10 pM,检测下限达到60 fM。以TMR为荧光标记,凝血酶检测的线性范围为5 pM到98 pM,检测下限为2.8 pM。可见,相比于TMR,以量子点为荧光标记的检测下限降低了47倍。这归因于量子点的高摩尔吸光系数和强光稳定性等优越的光学特性。 3.基于单颗粒成像,研究了水溶性氨基化CdTe量子点与1-丁基-3-乙基咪唑四氟硼酸盐离子液体([BEIm]·BF_4)作用后单个颗粒荧光性质变化。结果表明,量子点刚进入离子液体时,由于脂溶性离子液体的保护,量子点荧光强度和抗光漂白性能增强;随着与离子液体作用时间的延长,量子点闪烁现象变得明显,荧光强度和抗光漂白性能都有所减弱。红外光谱、荧光光谱以及量子点与NaBF_4溶液作用的结果表明,量子点闪烁现象、荧光强度和抗光漂白性能的变化可能是由于BF_4-结合到了量子点颗粒表面,并对量子点产生了刻蚀作用,使量子点的表面缺陷增加。本工作有助于了解离子液体与量子点的相互作用机理。