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基于构象转换和聚合酶反应的核酸适配体传感分析方法及应用研究

何婧琳  
【摘要】:核酸适配体(Nucleic acid aptamers)是通过配体指数级富集系统进化(SELEX)技术,筛选到的与生物小分子、蛋白质分子、细胞等高特异性结合的DNA或RNA片段。它们形成的高级结构能够识别与之相对应的靶分子,并形成高亲和力的靶分子-适配体复合物。与蛋白质抗体相比,适配体具有靶分子范围广、容易人工合成与修饰、高亲和力、分子量较小、稳定性好、变性和复性快速可逆等很多独特优势。 在分析化学领域,核酸适配体可以代替传统抗体、酶等物质,作为特异的分子识别元件用于生物传感体系中。适配体工作的基本原理是靶分子的引入能够使适配体发生构象转化,从而导致一系列光化学、电化学等可检测的信号改变。基于上述考虑,综合前人的工作,我们开发出基于结构转化的适配体传感体系用于检测蛋白质或小分子,这些传感体系灵敏、快速、选择性好。然而,单纯利用适配体结合靶分子前后构象变化引起信号改变的检测方法,在进一步提高灵敏度方面已经十分有限。为了对低含量的靶分子进行超灵敏检测,必须对检测体系进行放大信号或者降低背景的处理。我们设计的实验方法是在适配体结合可卡因发生构象变化后,引发聚合酶反应,将适配体结构进一步改变,从而使得光信号或电信号的放大,传感体系的灵敏度由此提高。 具体情况如下: 第2章描述了一种基于适配体-靶分子相互作用引起链置换聚合酶反应的新型荧光方法,它可以用于可卡因的检测。新设计的探针分别为发卡型探针和单链探针,它们分别含有部分可卡因适配体的识别序列。当可卡因存在时,这两条探针与靶分子结合形成三元复合物。发卡探针构象的变化导致发卡结构打开与引物杂交。在聚合酶与dNTPs的作用下,复制发卡探针的单链部分引发了引物延长进程。当发卡探针完全变成双链结构,单链探针和可卡因被释放出来与另一个发卡探针结合,从而开始新一轮的放大循环。在双链嵌入剂SYBR Green I插入到新合成的DNA双螺旋结构后可以观察到荧光信号成倍增强。这种新设计方案检测可卡因浓度可低至2 nM,整个反应仅使用一支封闭离心管让均相检测十分方便。与已经报道的可卡因适配体传感体系相比,我们提出的方法经济实用,具有优良的灵敏度和选择性。 我们利用相似的原理在第3章设计了利用聚合酶反应构建电化学适配体传感器,用于可卡因的高灵敏检测。游离在溶液中的发卡探针含有可卡因适配体序列,固定在电极表面的短链探针可与发卡探针茎干部杂交。可卡因的引入可使发卡探针打开与固定探针结合。在聚合酶作用下,固定探针作为引物dATP、dGTP、dCTP以及二茂铁标记的dUTP依序生长。洗去未反应物质后,电极表面的一条固定探针上标记着多个二茂铁分子,实现电化学信号放大。 为了提高小分子腺苷传感体系的灵敏度以及进一步降低检测成本,第4章开发了一种利用双链嵌入剂SYBR Green I作为报告基团的非标记适配体荧光传感探针。将腺苷适配体序列分为两段,分别延长形成两条探针。在自由状态下,两条探针呈游离状单链形式,双链嵌入剂的荧光很弱。腺苷引入后,由于适配体与腺苷固有的亲合力作用,两条探针相互结合形成双链结构。随着双链嵌入剂的加入,可以测到较强的荧光信号。由于传感探针采用了双链嵌入剂作为报告基团,探针能够以较低的浓度存在于体系中,而腺苷不需要过高浓度就可以引起适配体发生构象改变,这样的设计提高了传感体系的灵敏度。与使用标记荧光基团的探针相比,本实验方法价格低廉,具有更佳的实用性。 第5章提出了IgE荧光增强均相检测体系。以德克萨斯红标记的DNA(T-DNA)作为信号探针,以4′-(4′-二甲基氨基叠氮苯)苯甲酸(Dabcyl)标记的另一条DNA(Q-DNA)为淬灭探针,两条探针分别能够在IgE适配体相邻部位发生杂交。IgE不存在时,由于淬灭基团与荧光基团之间发生能量转移而有效降低荧光背景。IgE存在时,形成IgE/适配体/T-DNA的三元复合物而释放出Q-DNA,其荧光强度明显升高。用这种方法检测IgE取得的动力学响应浓度范围为9.2×10~(-11)到3.7×10~(-8) M,检测限为5.7×10~(-11) M。 第6章中,我们报道了在均相中检测人弹性蛋白酶(HNE)的荧光适配体传感探针。该生物传感探针包含一条短的DNA抓取序列(SS),它同时与部分适配体探针序列以及分子信标的环状部分互补。其工作原理是适配体与分子信标同时竞争结合SS序列。适配体-HNE识别后降低了适配体结合SS序列的能力,而双标记的分子信标更多地与SS序列结合导致荧光增强。该新型的生物传感探针可以检测到0.34 nM HNE,线性范围在0.34 nM~ 68 nM之间,其检测下限为47 pM。 第7章描述了在金电极上生物催化生长高密度金团用作固定适配体探针载体的方法。这种方法提供了在表面活性剂和还原辅酶存在的情况下,以连接在电极表面的12 nm纳米金为金种从AuCl4?生物催化还原Au原子的简便策略。生长过程由电化学阻抗(EIS)和扫描电子显微镜(SEM)监测。这种纳米结构界面非常有效地用于适配体探针固定。由于该增强基底良好的性能,适配体传感界面在交流伏安(ACV)和表面增强共振拉曼光谱(SERRS)检测中表现出良好的应用性能。


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