磁性纳米颗粒固定纤维素酶和产酶丝状真菌转化的研究

【摘要】：纤维素酶是一组具有纤维素降解能力酶的总称,它们协同作用可以将纤维素物质水解成简单糖,进而发酵产生乙醇,从而应用于农业、再生能源以及环境保护等领域。将已商业化的分泌型木霉生产的多组分纤维素酶有效固定化,不仅可以提高酶的稳定性、重复性,降低应用成本,还能为其他大分子底物的多酶体系的合理共固定研究奠定基础。本研究主要开展磁性纳米颗粒固定化纤维素酶和丝状真菌转化系统研究,获得了以下主要研究结果: 一、以Fe_2O_3纳米颗粒和聚乙烯醇为载体物理交联固定纤维素酶方法的建立。采以Fe_2O_3纳米颗粒为载体,以聚乙烯醇为包覆物和交联物对纤维素酶进行反复冻融固定,形成了催化性质稳定的固定化复合物。采用透射电镜、红外光谱仪、振动样品磁强度计对固定化酶复合体进行了表征,结果显示:固定化酶凝胶团由大小约1μm的微凝胶团组成,微胶团内含10 nm左右的Fe_2O_3纳米颗粒。对影响固定化因素的研究发现:当pH为6,固定化时间为11 h,纤维素酶/PVA为4,PVA/Fe为50时,固定化纤维素酶效果最高。通过该方法固定后酶活回收率达42%,经过5次反应后的固定化酶相对酶活力仍保留50%以上。结果表明:基于Fe_2O_3纳米颗粒和聚乙烯醇为载体的反复冻融法可以有效固定纤维素酶。 二、以牛血清蛋白(BSA)为模式蛋白,建立了采用硅油/Span80微乳体系固定化蛋白质的方法,并探讨了pH对固定化蛋白质在复合物空间分布的影响。对制备的BSA / PVA /Fe_2O_3纳米颗粒复合物进行酶联免疫、粒径、蛋白质含量分析,结果表明:较高pH值(pH=5、6)有利于BSA分布在复合物表层,而较低pH值(pH=3、4)使BSA则更多地镶嵌在复合物内层。透射电镜、zeta电位、红外光谱分析的结果显示BSA/PVA/Fe_2O_3纳米颗粒复合物粒径分布都较为均匀,具有球型核壳状的立体结构,并较好地保持了BSA的活力。 三、利用硅油/Span80微乳体系对纤维素酶(ICM)进行了固定,考察了油相种类、油水比、纤维素酶浓度,搅拌转速,pH值,交联方式等因素对固定化纤维素酶活力的影响。结果显示:采用硅油/Span 80体系,水/油比值为1/25,水相纤维素酶浓度为20 mg·mL~(-1),搅拌转速为2000 rpm,pH值为5的条件下固定化效果最佳。滤纸酶活力可达7 U·mg~(-1)。透射电镜和粒径分析表明该固定化酶的粒径为300 nm左右,并形成Fe_2O_3纳米颗粒聚集在内,高分子物质分布在外的复合物。振动样品强度分析显示该复合物的饱和磁化强度为4.87 Am2·kg~(-1),矫顽力为50 Oe,有较强的顺磁性,红外光谱分析表明纤维素酶固定在PVA/Fe_2O_3纳米颗粒体系中。对固定化酶的性质分析表明:该固定化方法虽然C1酶活力和β-葡萄糖苷酶活力均下降,但比游离酶的Cx酶活力85 U·mg~(-1)要高很多,显示该方法能够有效调整纤维素酶组分的位置。酶学性质研究结果显示该固定化酶水解曲线、最适pH值与游离酶等性能基本相似,并具有较强的耐机械剪切能力。 四、纤维素的晶体结构是提高酶活力的主要障碍之一,球磨技术虽然能够很好地破坏结晶纤维但是对酶活力影响也比较大。实验将固定化酶与球磨联用处理纤维素。酶活力和糖化分析结果表明:与球磨(300rpm)联合处理微晶纤维素(MCC) 6 h后,微乳固定化酶的单位蛋白酶活力是游离酶活力的3.5倍,且固定化酶与球磨对于微晶纤维素的降解具有明显协同作用。红外光谱、X晶体衍射和环境扫描电镜分析结果显示:球磨能够增加微晶纤维素的吸水量;微晶纤维的有序晶体排列在处理过程中被机械球磨降低,并使更多的不定型特性的纤维素纤丝出现,而固定化酶能够迅速降解这一不定型纤丝,从而使球磨和固定化酶呈现出良好的协同降解微晶纤维素作用,表明乳固定化酶结合湿法球磨是一种新型潜在的有效降解微晶纤维素的方法。 五、为了便于探索丝状真菌纤维素降解机制,对丝状真菌的转化方法进行了探索,建立的农杆菌介导的丝状真菌转化体系。利用根癌农杆菌LB4404和质粒pPK2成功实现了简青霉菌株的转化。通过分子检测表明,hph基因成功转化至简青霉中,而且呈单拷贝。转化过程中影响遗传转化效率因素的研究结果表明在乙酰丁香酮浓度为250μM、OD值在0.8、共培养时间为48 h的条件下转化效率最高。验证结果表明在该条件下,平均转化率可达50个转化子/105孢子。该转化体系的建立为建立更合理的固定化纤维素酶模式奠定了基础。