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基于核酸探针构型转换的生物传感放大技术研究

阳怡锋  
【摘要】:核酸适体是从人工构建的随机寡核酸文库里筛选出来与配体高效、专一结合的DNA或RNA片段,这种筛选技术称为“指数富集的配体系统进化”(SELEX)。适体能与靶物质进行高度特异性的结合。核酸适体的成功问世,纠正了很久以来关于核酸只是遗传信息存储和转运载体的看法。核酸适体能特异性地结合蛋白质、多肽、有机物、金属离子等多种靶物质。相对于抗体,适体还有特异性高、亲和力好、制备运输简便、目标广泛等优点。 正因为适体这些独特的优点,适体作为特异性的分子识别元件被广泛应用于生物传感体系中。核酸适体生物传感器(aptamer sensor)是一种能够连续和可逆地进行分子识别的装置。基本原理为待测物质通过具有分子识别功能的接受器时,固定在接受器上的亲合配基与待测生物分子相互作用的瞬间发生能量转移,经过换能器,以电或光等方式输出,经过电子系统的放大处理和显示,可以对待测物质进行定性定量检测。这些传感体系灵敏、快速、选择性好,但是单纯利用适配体结合靶分子前后引起信号改变的检测方法,在提高灵敏度方面十分有限。为了实现对低浓度的目标物进行高灵敏度检测,我们对传感体系进行了信号放大处理,本论文前两部分内容就是对适体检测体系信号放大方法展开研究,后一部分研究核酸探针HCR放大技术。 第二章设计了一种基于KF聚合酶反应的电化学适配体传感器,联合二茂铁功能化寡聚核苷酸,成功地检测了可卡因小分子。可卡因存在时,识别探针改变它的发卡构象,形成三叉复合物。适配体-可卡因复合物3‘端单链部分与捕获探针互补杂交。在聚合酶作用下,以识别探针为模板,以捕获探针为引物进行聚合延长反应。二茂铁标记的dUTP聚合在新合成的互补探针中,达到信号放大的目的。 第三章设计了一种无标记,自锁式双功能寡聚核苷酸探针,用于不同的疾病标记物的平行检测。两种基于等温循环链置换聚合反应(CNDP)和循环非核酸目标置换聚合反应(CCDP)的信号放大技术分别用于检测p53基因和PDGF-BB。在目标物存在的情况下,双功能探针与目标物形成一个三叉复合物,解开其中一个茎干的自-互补部分,释放出与引物互补的片段,引发等温聚合取代反应。产生大量的聚合产物,通过双链插入剂SYBR Green I插入双链DNAs,当有单色光源的激发时,能发出放大的荧光,达到信号放大的目的。实验结果证明基于等温聚合取代反应的双功能探针检测体系的有效性,且不需要化学标记,具有设计弹性大、便捷性、简单性和成本低的特点。 第四章提出了一种基于HCR放大反应检测DNA单碱基突变的电化学传感器。实验中设计的目标链不仅与捕获探针杂交,而且它的延长部分与引发链互补,引发链能引发HCR放大反应的发生,放大产物上的生物素与标记碱性磷酸酶的链霉亲和素反应,通过测量1-萘基磷酸盐底物酶催化反应后的电化学信号变化,实现对目标DNA的定量检测。实验结果表明该传感器对p53突变基因的检测具有高度的灵敏性,并能够在实际样本中特异性区分错配序列。


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