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枝孢菌Cladosporium sp.Bio-1的木质纤维素降解特性研究

靳冉  
【摘要】:筛选并改造获得高效木质纤维素降解微生物在生物能源、环境保护等领域具有重要的应用价值。本论文从收集自长沙岳麓山土壤环境中的真菌中,筛选出一株能够以碱木质素为唯一碳源生长的菌株,命名Bio-1。结合Bio-1培养特征、菌株形态特征及18srDNA、ITS基因序列的系统发育分析,确定该菌属于枝孢菌属Cladosporium。 对Bio-1的产酶能力研究发现,它胞外和胞内均能够产木质素降解酶,漆酶。第8天其胞外和胞内漆酶活性达到最大值,分别是241U/L和187U/L。在第4天向培养基中加入0.5mmol/L CuSO4作为漆酶诱导剂后,第8天测得的胞外和胞内酶活性均有显著增加,达到3800U/L和5352U/L,超过了一些经典的产漆酶真菌的产酶能力。同时,Bio-1也具有产生胞外和胞内纤维素酶内切葡聚糖酶的能力,菌株培养至第8天测得其最高酶活分别是51U/mL和2.9U/mL。 为了更好地开发应用Bio-1菌株,本论文为进一步开展转化研究进行了两项前期工作。我们分别使用含有碱木质素、纤维素钠和桦树木聚糖为唯一碳源的培养基,以不同孢子接种浓度及不同生长时间内Bio-1的生长状况为检测指标,优化出一套简单有效的筛选具有木质素或纤维素或木聚糖降解能力转化子的方法,即以孢子浓度为108个/L接种,在少于60h能长出明显菌落的转化子,就是降解能力强于野生型的转化子。此外,我们构建了一个具有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和潮霉素B抗性基因(hph)双标记的质粒载体,为高效筛选Bio-1的转化子提供了有力的工具。经过测序并在大肠杆菌中表达,确定重组质粒中的hph和EGFP基因能够正常表达。 本论文筛选鉴定出一株木质纤维素降解真菌并对其产酶能力进行分析,同时为其进一步开发利用开展了前期工作,为最终获得应用于生物能源与环境污染处理的优良菌株打下基础。


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