拟南芥HAI-1和AtCAL基因的功能和生理生化分析

【摘要】：PP2C蛋白磷酸酶(PP2C-type protein phosphatases, PP2C)是一类以丝氨酸/苏氨酸残基蛋白磷酸酶,在细胞内以单体形式存在,酶催化活性依赖于Mg2+或Mn2+。 PP2C通过去磷酸化作用负调控蛋白激酶级联信号系统,参与细胞周期、胁迫信号传导、基因转录、蛋白质翻译及翻译后修饰的细胞活动过程,H2O2、不饱和脂肪酸、Cat+/CaM、脂质信号分子等均可调节PP2C的活性。针对HAI-1基因和AtCAL基因的功能进行研究,取得了如下的研究结果： (1)以TAIR网站(www.arabidopsis.org)提供的HAI-1基因组序列,对其进行生物信息学分析。顺式作用元件是同一DNA分子中具有特殊功能的转录因子DNA结合位点和其它调控基序,其中ABRE、CAAT-box、CGTCA-motif、G-Box、TGACG-motif等出现的频率较高。对HAI-1蛋白序列信号肽进行预测和分析,得出其蛋白序列内没有信号肽,不属于分泌类蛋白,可能是细胞器类蛋白(如叶绿体、线粒体等)。 (2)构建HAI-1::GFP融合表达载体,对拟南芥HAI-1基因进行亚细胞定位分析。基因枪轰击融合表达载体入洋葱表皮细胞,进行瞬时表达分析,结果表明绿色荧光蛋白在细胞核表达,说明HAI-1蛋白属于核蛋白。构建了HAI-1基因Promoter::GW-GUS表达载体,遗传转化入拟南芥花蕾中,收获T0代种子,筛选鉴定纯合子,获得阳性植株。GUS组织化学染色表明,所克隆的HAI-1基因上游的1681bp和启动子下游221bp的片段具有完整启动子的活性,具有时空表达的特异性。同时也说明HAI-1基因在萌发和生长过程中,受到ABA等激素和损伤的诱导表达。 (3)HAI-1基因突变体种子萌发试验表明,0.1μM ABA处理,白光下连续培养7天,野生型和hai-1突变体的种子萌发率差不多,而过表达转基因植株的种子萌发率在前4天要明显低于野生型和hai-1突变体。低温处理7天后,在没有添加ABA激素的MS培养基平板上,绿苗率都为100%,随着ABA浓度的升高,hai-1突变体种子显示出明显高于野生型和过表达转基因植株种子的绿苗率,当ABA浓度为0.6μM时,所有的突变体种子的绿苗率都为零。 HAI-1基因突变体种子的萌发率和绿苗率试验表明,NaCl胁迫处理下,hai-1突变体种子的萌发情况跟种子没有明显差异,当NaCl的浓度为20mM时,HAI-1基因的各突变体种子在第4天,几乎都已经100%萌发,而hai-1突变体的绿苗率明显要高于野生型植株和过表达转基因植株。 (4)从长期的失水试验来看试验的结果,过表达转基因植株和野生型植株萎焉程度差不多,表现出对干旱较敏感。而hai-1突变体在失水12天后,未出现明显的萎焉,说明对干旱具有一定的耐性。从短期失水试验的结论跟长期失水实验大体相当,置于干燥空气中4小时后,叶片鲜重最重的是hai-1突变体植株,其次是野生型植株,最后是过表达转基因植株。 (5)以8天苗期的植株为材料,提取RNA,并逆转录成cDNA,运用Q-PCR的方法来研究ABA各胁迫应答基因在野生型植株和过表达转基因植株的不同组织部位(整个植株、叶和根)中,结果发现,其表达情况各异,没有很明显的规律。ABI1基因在过表达转基因植株中的表达明显高于野生型植株,无论在整个植株、叶还是根中。而ABI2基因在整株中的表达是野生型植株高于过表达转基因植株,但在根和叶中,过表达转基因植株该基因的表达量明显高于野生型植株。这说明ABI2基因在其他组织部位中,野生型植株中的表达要高于过表达转基因植株。其它ABA相关基因的定量结果相类似。 (6)对野生型植株和过表达转基因植株的叶片下表皮的气孔开放度进行统计,结果发现在不同浓度的ABA胁迫下,其气孔开放度不同。在没有激素ABA胁迫时,过表达植株的气孔开放度略高于野生型植株的气孔开放度。但随着ABA的施加,则发生了变化,当ABA浓度为1和10gM时,野生型植株的下表皮叶片的气孔开放度都明显高于过表达植株的气孔开放度。这说明突变体植株表现出对ABA的超敏感,使得其气孔开放度要小于野生型植株的气孔开放度。 (7)从营养生长来看,Rat2/RatlRNAi双突变体植株具有明显晚花表型。对各突变体的种子进行萌发实验来看,随着NaCl浓度的升高,各突变体材料的萌发率也随之降低,其中Rat2/RatlRNAi双突变体的萌发率最低。将构建好的AtCAL1::GFP和AtCAL2::GFP融合质粒,轰击洋葱表皮。荧光显微镜观察发现,在洋葱表皮细胞的细胞核中都有绿色荧光蛋白的激发,说明AtCAL1蛋白和AtCAL2蛋白都定位在核中。