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体外组织工程支架材料的制备及其对成骨细胞增殖的影响

夏磊磊  
【摘要】:因为从患者身上获取种子细胞来源有限,所以如何实现种子细胞体外高活性快速扩增成为组织工程及时治疗患者的瓶颈问题之一。三维体外细胞培养是实现种子细胞体外高活性快速扩增的有效途径,而应用三维多孔支架材料是该方案能否实现的关键。本论文对体外组织工程三维支架材料制备与调控细胞增殖行为机制等关键科学问题进行了探索和研究,以奠定实现组织工程中种子细胞体外高活性扩增的研究基础。 本论文以发泡法、模板法制备多孔炭支架材料,并在此基础上采用羟基磷灰石涂层对其进行表面修饰,制备HA/多孔炭支架材料,用于实现成骨细胞体外高活性扩增。该支架具有较高的平均开孔率(83.5%)和三维连通多孔网络结构,孔径分布为200-500gm,力学性能与多孔炭基体一致,表面细密的片/针状羟基磷灰石涂层对提高细胞的增殖促进作用明显,并且加速细胞的附着行为。与传统的二维细胞培养模型相比,HA/多孔炭支架材料能显著提高细胞的增殖行为;经过7d培养后,发泡法、模板法制备的HA/多孔炭支架材料的细胞增殖率分别为6.7倍、10.1倍,而在传统的二维培养的细胞增殖率仅为4.2倍。利用HA/多孔炭支架材料,初步设计小型灌注式生物反应器构建体外三维细胞培养模型,发现动态培养7d后细胞数量为静态培养的2.4倍。 本论文研究了溶剂铸造和粒子溶出法制备淫羊藿苷/PHBV多孔支架材料,并利用中药有效成分促进成骨细胞体外高活性扩增。实验数据表明,淫羊藿苷/PHBV多孔支架材料的平均开孔率为88.8%,抗压强度为0.27MPa。药物释放曲线检测表明,淫羊藿苷/PHBV多孔支架材料第一天即可检测到向溶液中释放中药成分,浓度约为4.67mg/L,并且在28d内可以观察到淫羊藿苷的连续释放过程,且未出现药物的突释现象。同时还发现当细胞与支架材料接触培养时,经5d培养后,细胞增殖率为非接触组的1.5倍,由此表明细胞在支架材料的接触式培养可有效促进中药成分因子通过细胞膜直接进入细胞,提高药物利用率。与此同时,对比细胞在细胞培养板和淫羊藿苷/PHBV多孔支架材料的增殖率发现,MG-63细胞培养在淫羊藿苷/PHBV多孔支架材料时细胞的增殖率增加2.3倍,MC3T3-E1细胞增加1.7倍。通过RT-PCR检测MG-63细胞在二维培养皿、二维PHBV膜、三维PHBV多孔支架材料和三维淫羊藿苷/PHBV多孔支架材料四种材料上RNA转录行为,发现三维淫羊藿苷/PHBV多孔支架材料在细胞附着时会强化FN与TGF-β1两个基因的转录水平,增强细胞外基质的形成;在前期增殖行为中诱导了一些生长因子基因和细胞外基质基因的转录,包括骨形态发生蛋白相关基因BMP2、BMP6、BMP7,最后强化细胞外基质基因BGN转录行为,提高细胞外基质对生长因子的锚定作用,而三维空间结构在细胞增殖期间抑制TGF-β1和Col-I转录。利用淫羊藿苷/PHBV多孔支架材料,初步设计中型灌注式生物反应器构建体外三维细胞培养模型,发现动态培养最多使细胞数量为静态培养的4倍。 本论文研究了利用溶剂挥发法在多孔炭支架材料表面修饰载药PHBV涂层,制备载药PHBV/多孔炭支架材料,考察其对细胞增殖的调控作用。实验数据表明,制备的载药PHBV/多孔炭支架材料平均开孔率相较于多孔炭支架材料有所下降,均值为84.2%,但保留了三维多孔连通网络结构,连通孔孔径范围为200-500μm,抗压强度、抗折强度和抗拉强度分别为1.076MPa、0.819MPa和0.187MPa。载药PHBV/多孔炭支架材料同样发现具有可控药物释放行为,经过7d的释放PBS中药物浓度为0.727mg/L,而在28d后该值达到了1.207mg/L。载药PHBV/多孔炭支架材料上细胞的附着行为正常,在经过3d的培养后,能明显增强细胞的增殖,培养7d后MG-63细胞达到10倍的增殖,为二维细胞培养的2.5倍。 总之,本论文通过系统研究体外组织工程细胞培养多孔炭支架、多孔PHBV支架的制备与表征,发现经HA、PHBV、淫羊藿苷对上述支架进行表面修饰后,能明显促进成骨细胞的增殖行为,论文进一步阐明了支架材料及表面修饰对细胞增殖影响的生物学机制,为支架材料应用于组织工程种子细胞的体外扩增奠定了理论基础。


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