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新型肝炎病毒感染体系构建及抗病毒先天免疫应答研究

杨大荣  
【摘要】:全球有超过5亿人口属于丙型肝炎病毒(HCV)和/或乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染人群,这些感染者有可能逐步发展为慢性肝炎、肝硬化和肝癌。因缺少理想的病毒感染体系而制约了病毒生活周期、先天免疫反应以及发病机制的相关研究,从而阻碍了研发抗病毒药物的进程。尽管乙肝病毒的预防性疫苗早已上市,HCV疫苗却还未研发成功。相比于其它大部分的病毒感染,HCV感染的主要特征是极易形成慢性感染(约80%)。另一方面,约有20%的HCV感染者能够自动清除体内病毒而不需要接受治疗,表明宿主的先天免疫反应可以控制病毒感染。在病毒感染过程中,诱导I型干扰素和干扰素刺激基因(ISGs)是宿主抵御病毒的主要方式。宿主通过模式识别受体(PRRs)捕获病毒感染所形成的病原体相关分子模式(PAMPs),激活先天免疫应答系统。主要的PRRs包括RIG-I样受体(RLRs)、Toll样受体(TLRs)、Nod样受体(NLRs)和蛋白激酶R(PKR)。然而,HCV和肝细胞抗病毒先天免疫反应之间的复杂相互作用机制未知。本研究工作旨在研发一个理想的HCV和HBV感染细胞培养体系,并基于此体系探究宿主应答病毒感染的先天免疫机制。第一,我们成功分离了一株新型肝癌细胞系HLCZ01。该细胞系来源于一位患有高分化肝癌的男性病人的肝组织。HLCZ01细胞的形态酷似人正常原代肝细胞(PHH),并表达多种肝细胞特异性标志物,包括白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、肝细胞核因子4(HNF4)、细胞色素CYP3A4和mi R-122。同时,HLCZ01细胞还表达HCV的四种受体,分别为CD81、SR-BI、CLDN1和OCLN。第二,HLCZ01细胞系支持HCV和HBV感染的完整生活周期。HLCZ01细胞既支持实验室来源和临床病人血清中的HCV感染和复制,又支持体外来源的和体内病人血清来源的HBV感染和复制。从病毒感染的HLCZ01细胞中组装和释放的HBV和HCV可以再感染原始的HLCZ01细胞。HLCZ01细胞支持HBV和HCV共感染,并且这两种肝炎病毒在HLCZ01细胞中的复制互不干扰。抗HBs Ag和抗CD81特异性抗体可分别阻断HBV和HCV入侵HLCZ01细胞。已开发的抗病毒药物可有效抑制HBV和HCV在HLCZ01细胞中的复制。HLCZ01是世界首例支持HBV和HCV病人血清直接感染以及HBV/HCV共感染的肝癌细胞系,这株细胞系可应用于肝炎病毒生活周期、肝细胞与肝炎病毒相互作用的研究以及抗病毒药物和疫苗的研发。第三,HLCZ01细胞和PHH具有完整的先天免疫应答系统。一方面,HCV感染肝细胞后可诱导IFN-β和G1P3、ISG12a以及1-8U等抗病毒ISGs的表达。在HLCZ01细胞中,HBV的存在并不影响HCV诱导IFN-β和ISGs的产生。另一方面,HCV感染HLCZ01细胞和PHH至相对较长时间点时,可诱导病毒感染细胞凋亡,这可能是宿主细胞清除病毒的另一种先天免疫应答方式。在肝细胞中沉默TRAIL可抑制HCV诱导的细胞凋亡。RIG-I缺失可下调IFN-β和TRAIL的表达,并阻断病毒诱导的细胞凋亡,从而促进病毒复制。IRF3是RIG-I的下游信号分子,同样参与了TRAIL介导的肝细胞凋亡。第四,mi R-942通过调控ISG12a表达以介导HCV诱导的细胞凋亡。借助于HLCZ01细胞感染体系,找到了介导HCV所致细胞凋亡的重要调控分子ISG12a及其参与HCV诱导细胞凋亡的信号通路。经生物信息学方法预测和实验验证显示,mi R-942是ISG12a的负调控因子。HCV感染可下调mi R-942的表达,并且mi R-942与ISG12a在HCV感染的肝细胞和肝组织中的表达呈负相关性。过表达或沉默mi R-942可分别减弱或增强HCV诱导的细胞调亡。同时,促凋亡蛋白Noxa在HCV感染细胞中被诱导表达,诱导的Noxa可介导ISG12a依赖的肝细胞凋亡。综上所述,本研究工作构建了一株支持HCV和HBV完整生活周期的新型肝癌细胞系HLCZ01。借助于该感染体系,初步揭示了若干宿主应答病毒感染的先天免疫反应节点。RIG-I通路在HCV感染诱导I型干扰素产生和引发TRAIL介导的病毒感染细胞凋亡途径中起关键作用。mi R-942通过调控ISG12a表达可介导Noxa依赖的HCV所致细胞凋亡。


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