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沼泽红假单胞菌定殖动态及其胞外多糖结构鉴定与诱导抗病机制

翟忠英  
【摘要】:沼泽红假单胞菌,其菌株富含多种生物活性因子,被广泛应用于食品工业、畜牧养殖、环境治理以及农业等领域。微生物胞外多糖作为一种高分子天然化合物,广泛存在于细菌、真菌以及海藻生物中。因其具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒,且能够增强生物体免疫力等特性,在众多领域具有广阔的发展潜力和应用前景。在前期研究中,筛选到一株叶际生防菌沼泽红假单胞菌GJ-22,其不仅可以促进植物生长,还能通过产生IAA和ALA两种植物激素诱导烟草产生对于烟草花叶病毒(TMV)的抗性。本文以沼泽红假单胞菌GJ-22为研究对象,通过构建荧光标记菌株GJ-22-gfp,观测菌株在烟草叶际定殖动态。通过构建沼泽红假单胞菌胞外多糖合成基因突变体,发现胞外多糖的产量和菌株定殖动态以及诱导植物抗病性相关联。本研究利用离心、醇沉的方法从沼泽红假单胞菌GJ-22发酵液中提取到了一种胞外多糖,对其分子结构进行表征分析,并进一步对胞外多糖诱导烟草抗病机制进行研究,为沼泽红假单胞菌胞外多糖的开发应用提供更多的理论依据。具体研究结果如下:一、荧光标记菌株的构建基于沼泽红假单胞菌荧光标记菌株构建困难,且难以表达的问题,本研究利用同源重组的方法,成功构建携带绿色荧光蛋白基因的重组载体p BBR1-pck A-gfp。再利用电击转化的方法将重组载体转化到沼泽红假单胞菌GJ-22感受态细胞中,构建沼泽红假单胞菌荧光标记菌株GJ-22-gfp。同时对标记菌株生长代谢、质粒表达稳定性以及生防功能进行验证。结果表明,和野生型菌株差异不显著,可以用于后续研究。二、沼泽红假单胞菌在烟草叶际定殖动态观测及影响因子鉴定通过激光共聚焦荧光显微镜(CLSM)和扫描电镜(SEM)对标记菌株在烟草叶际定殖动态进行观测研究。结果表明,菌株在叶际定殖动态一共分为四个阶段。阶段I:在细菌定殖初期,大多数细菌以游离形态散乱分布于叶片表面;阶段II:细菌数量急剧减少,形成小的细菌群,存活于叶片表皮细胞连接处;阶段III:细菌数量趋于稳定,小的细菌群落聚集在一起,形成了小的细菌微菌落;阶段IV:细菌定殖达到成熟期,数量缓慢上升,小的细菌微菌落成长为大的细菌聚集体,并向周围扩散。通过对不同定殖时期诱导植物抗病性检测,结果表明当细菌在宿主植物叶际定殖状态为阶段III或阶段IV时期时,能够增强植物诱导抗病性,增强植物免疫力。通过对胞外多糖合成基因突变体菌株的胞外多糖含量,菌株定殖数量以及诱导抗病性进行分析,结果表明,突变体菌株△Exop1产胞外多糖含量显著降低,且菌株定殖数量显著减少,诱导植物抗病性也显著减弱。因此,胞外多糖对于菌株在植物叶际定殖发挥着重要的作用,从而影响菌株对烟草诱导抗病性。三、沼泽红假单胞菌胞外多糖的分离、纯化以及鉴定通过离心、醇沉的方法从菌株GJ-22发酵液中提取到了一种胞外多糖,经过纯化,得到单一组分的纯多糖G-EPS。经过高效凝胶渗透色谱仪对胞外多糖分子量进行测定,结果显示G-EPS分子量大小为10.026 KD,红外光谱表征结果显示其为α-糖苷键构型。将多糖水解后并进行衍生化,后利用GC-MS分析其单糖组成,结果显示胞外多糖由甘露糖和葡萄糖两种单糖单元组成,比例为116:9。通过综合甲基化、1D NMR以及2D NMR分析的数据,最终得出G-EPS是由(1→)连接甘露糖,(1→2)连接甘露糖,(1→3),(1→6)连接甘露糖和(1→2,6)连接甘露糖组成的,摩尔比分别为3.1:2.0:0.8:0.6:3.5。并最终推断出G-EPS分子结构式,为以后胞外多糖构效关系研究以及结构优化提供有效的理论依据。四、转录组分析胞外多糖诱导烟草抗病机制以本氏烟作为研究对象,研究胞外多糖水溶液处理和dd H_2O处理的转录调控差异。结果表明,处理组和对照组有6049个差异基因,包括2283个上调基因,3766个下调基因。通过KEGG富集分析,以及对显著差异表达的基因进行q PCR检测,结果表明G-EPS通过激活SA,JA/ET以及MAPK信号途径诱导植物免疫反应。五、胞外多糖G-EPS通过诱导烟草防御酶活性增强免疫防御反应使用胞外多糖G-EPS处理烟草后,对烟草生长以及诱导抗TMV的作用效果进行研究。结果表明,胞外多糖G-EPS能够显著促进植株生长,比对照处理的根长和干重分别增加26.55%和37.1%。且经过G-EPS处理的烟草植株,对于TMV的抗性显著增强。本研究对经过G-EPS处理后的烟草叶片中和抗病相关防御酶的活性进行研究。结果表明,G-EPS能够显著增强植物POD,PAL以及SOD酶活性,同时增强了植物体过氧化氢以及叶绿素的含量。通过促进植物体光合作用、植保素以及木质素的合成,提高植物对病毒的抗性。此外,G-EPS处理降低了植物体内丙二醛(MDA)的含量,减少了病毒对植物细胞膜的破坏,增强植物免疫抗性。


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