纳米活性界面构建新方法用于电化学生物传感器设计

【摘要】：基于生物识别的高度专一性与电化学信号检测的放大作用相结合的电化 学生物传感器，具有灵敏度高、选择性好、易于微型化和自动化等优点，在临 床诊断、生物分析、环境监测等领域具有广泛的应用前景。在电化学生物传感 器的研制中，一个关键的技术就是如何将生物材料稳定、高活性地固定到基体 电极表面，构成生物传感器的敏感膜。本研究工作致力于发展新型生物材料固 定方法，以达到改进固定生物材料活性、延长传感器使用寿命等目的，主要完 成了以下研究工作： 1、 发展了3种在电极表面形成纳米Au活性界面的新方法，并用于固定酶 或免疫试剂，构建电化学酶或免疫传感器。 (1) 用壳聚糖修饰石墨粉，用固体石蜡作粘结剂，制备得到壳聚糖修饰的 碳糊电极(CCPE)，壳聚糖分子中含有丰富的-NH2，因此，所制备CCPE表面 含有大量-NH2，而-NH2可以与纳米Au强静电结合，于是在CCPE表面形成稳 定的纳米Au层。在第2章中，报道了基于CCPE支持的纳米Au层固定辣根 过氧化物酶(HRP)制备H2O2生物传感器，负电性的纳米Au层可以稳定固定 正电性的HRP，并有效保持其生物活性，制备得到性能良好的传感器，对H2O2 测定的线性范围为1． 22×10-5-2． 43×10-3mol/L，灵敏度为0． 013 A·L/mol·cm2，使用寿命大于3周。因为抗体蛋白质含有-SH，易于在Au或纳 米Au表面固定，第7章中报道了用CCPE支持的纳米Au层作免疫传感界面， 用于直接吸附固定抗体及进行免疫反应。分析步骤包括首先将日本血吸虫抗体 吸附固定在纳米Au层表面，用牛血清白蛋白封闭，通过竞争型免疫反应方式 将待测血吸虫抗原和酶标抗原一起结合到电极表面，最后进行电化学检测。研 究表明：纳米Au层是合适的免疫分析传感界面。这种方法有以下几个优点： 简便的纳米Au层形成方法、抗体易于固定并能有效保持固定抗体的生物活性。 检测血吸虫抗原的线性范围和下限分别为：0． 11-22． 4μg/mL和0． 06 μg/mL； 一次免疫分析完成后，结合到电极表面的免疫复合物可以用0． 5 mol/L的 NaCl-NaOH(pH 12) 溶液洗涤除去，再生纳米Au层用于下一次分析。 (2) 利用壳聚糖具有很强成膜能力的性质，在玻碳电极表面首先形成壳聚 糖膜，膜表面丰富的-NH2与纳米Au强静电结合，在玻碳电极表面获得稳定的 纳米Au修饰层。用形成的纳米Au层固定HRP单酶，可以制得测定线性范围 为6． 1×10-6-1． 8×10-3mol/L的H2O2生物传感器，使用寿命在1个月以上； 纳米活性界面构建新方法用于电化学生物传感器设计 若同时固定HRP和葡萄糖氧化酶(Gox)，则制备得到HRP/Gox双酶葡萄糖生 物传感器，对葡萄糖测定的线性范围为4.8 x 10一4一1.2 x 10一2 mol/L，此研究 内容列于第3章。 (3)用含一SH的硅烷化试剂:3一琉基丙基一三甲氧基硅烷作溶胶一凝胶单体， 石墨粉作导电材料，制备得到含一SH的溶胶一凝胶碳糊电极(MCCE)，电极表 面丰富的一SH可以与纳米Au共价结合，于是在MCCE表面形成共价修饰的纳 米Au层。第4章报道了基于MCCE支持的纳米Au层固定HRP制备HZO:生 物传感器，研究表明:纳米Au层可以稳定、高活性地固定酶，传感器制备操 作简便，具有快速反应和使用寿命长等特点，可在1.22 X10一5一1.10 X10一3mol/L范围内对H20:进行检测，反应时间小于85，灵敏度可达。.29 A.L/mol.c扩，使用寿命长达5周。第6章报道了MccE支持的纳米Au层作免 疫传感界面用于分析检测人补体C3，测定线性范围是:0.08~5.6料g/mL， 检测限为0.08林g/mL。 2、近年来，用溶胶一凝胶膜包埋生物材料制备生物传感器引起人们的关注， 但纯粹的硅溶胶一凝胶膜存在易破裂和易从电极表面脱落等缺点，研究表明: 将天然或合成有机聚合物掺杂到无机溶胶一凝胶膜，形成无机/有机杂化膜，是 解决这一问题的有效途径。在第5章中，首次报道了将负电性的天然聚合物褐 藻酸钠掺杂到硅溶胶一凝胶膜，形成一种新型的无机/有机杂化膜，并用于在玻 碳电极表面包埋酪氨酸酶，制备苯酚生物传感器。研究表明:掺杂褐藻酸钠， 可以明显改进硅溶胶一凝胶膜性能，有效保持被包埋酶的生物活性，所制备生 物传感器测定苯酚的线性范围为3.4~93.1林mol/L，传感器的使用寿命在3 周以上。 3、在第8章中，介绍了基于带相反电荷的天然聚离子强静电相互作用分 离免疫复合物的免疫分析新方法。用CNBr交联方法将转铁蛋白抗体与负电性 的褐藻酸钠共价交联，在液相均相条件下，负载转铁蛋白抗体的褐藻酸钠、分 析物转铁蛋白和酶标转铁蛋白进行竞争型免疫反应，可以明显缩短免疫培育时 间;然后，将表面正电性的包埋壳聚糖的碳糊电极置入免疫反应体系，聚阳离 子(壳聚糖)与聚阴离子(褐藻酸钠)之间的强静电相互作用使负载到褐藻酸 钠上的免疫复合物快速结合到电极表面，最后进行电化学检测获取响应信号。 本研究工作将均相免疫反应与快速异相分离相结合，建立了一种快速、灵敏的 免疫分析新方法，测定转铁蛋白的线性范围为1.9一78.8拼g/mL。 关键词:电化学生物传感器;纳米Au活性界面;生物材料固定;聚离子静电 相互作用;快速电化学免疫分析;无机一有机杂化膜