基于纳米颗粒的植物转基因及其检测研究

【摘要】：纳米颗粒作为基因载体和药物载体在动物细胞的研究中取得了初步进展,这是纳米生物技术所取得的主要成果之一。但是,纳米生物技术在植物生命活动中研究相对较少,有待开发其潜在的应用价值。因此,本研究以具有生物相容性的多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒(poly-L-lysine starch nanoparticle,PLL-StNP)为基因载体进行了植物转基因技术的研究,并就该技术相关的基础性科学问题进行了初步探讨,同时,将纳米颗粒与分子信标(molecular beacon, MB)结合,对目标基因及其表达进行活体、实时、超灵敏检测的研究,以实现在纳米尺度和单分子水平上获取生命活动过程的信息。通过研究,建立了基于纳米颗粒的植物转基因及其检测的新方法。 1.纳米颗粒基因载体的制备及其特性 纳米颗粒基因载体的制备:以可溶性淀粉为原料,制备了淀粉纳米颗粒(starch nanoparticles, StNPs)。以该纳米颗粒为内核,经多聚赖氨酸修饰,得到了多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒(PLL-StNPs)。在原子力显微镜下检测到这些颗粒的大小为50 nm左右,分散均匀。在pH 7-8的范围内,PLL-StNPs带正电荷。 纳米颗粒与DNA的结合:在PLL-StNPs溶液中加入质粒DNA,凝胶电泳分析,PLL-StNPs能有效结合DNA,而且PLL-StNPs能同时结合不同种类的DNA。洗脱复合物中的DNA,凝胶电脉分析,DNA条带没有改变,说明DNA能结合在PLL-StNPs上,也能从复合物上分离,因此,PLL-StNPs可用作多基因载体。将PLL-StNPs进行RuBPY修饰, RuBPY修饰的NPs仍能有效结合DNA。 纳米颗粒对DNA的保护作用:结合了DNA的NPs在超声波发生器中处理不同的时间后,进行凝胶电泳分析发现DNA仍与NPs结合。洗脱复合物中的DNA,经电泳发现DNA条带没有改变,表明NPs能有效地保护DNA防止超声波的破坏。用DNase I消化DNA-NPs复合物,洗脱复合物中的DNA,进行凝胶电泳分析,发现DNA条带均没有改变,实验结果表明DNA-NPs能较好地保护DNA防止DNase I的酶切。 纳米颗粒与植物细胞的生物相容性:在高渗作用或超声波介导下,将RuBPY修饰的PLL-StNPs导入盾叶薯蓣细胞,在激光共聚焦显微镜下观察发现,荧光纳米颗粒进入了植物细胞,主要分布在细胞质中,随着培养时间的延长,细胞中荧光纳米颗粒数目减少,荧光强度也减弱; 将有荧光纳米颗粒的细胞培养3~5天,在激光共聚焦显微镜下观察细胞中仍有荧光,但荧光的强度随着时间的延长而减弱,同时可在分裂的子细胞中观察到微弱的荧光。说明NPs能有效进入植物细胞,