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核酸识体与分子信标技术用于凝血酶检测的研究

仲志鸿  
【摘要】: 蛋白质是构成生物体的重要组成部分之一。相对于基因检测,蛋白质的检测也更为直接、准确,在疾病诊断中起着重要的作用。但是由于传统研究方法往往需要放射性标记、凝胶电泳和放射性自显影等繁杂操作,在一定程度上限制了人们对这些生命过程的深入研究。因此如何快速、简单、高效地对蛋白质进行分析,已经成为需要迫切解决的问题。本文以凝血酶为研究模型,基于核酸识体(aptamer)和分子信标(molecular beacon,MB)技术发展蛋白质分析的新方法。从该思路出发,本文开展了以下三方面的研究工作: 1、利用双发夹识体探针检测凝血酶 结合核酸识体和分子信标序列,设计无标记的识体探针检测凝血酶。识体探针呈双发夹结构,存在两段茎状分子内杂交,分子信标的对应打开序列被两个茎部杂交封闭。没有凝血酶时,分子信标会很难被识体探针打开;而有凝血酶存在时,凝血酶可以与识体探针外侧茎部的核酸识体结合,打开识体探针该部分的茎状结构,使得识体探针只剩余一个不稳定的茎状结构。此时,识体探针会较易与分子信标杂交,使分子信标产生明显上升的荧光信号。通过这种信号的上升程度,达到检测凝血酶的目的。该方法检测灵敏,特异性好。同时用该方法考察了粘多糖类化合物肝素在凝血酶与其抗体作用中的影响,结果与文献相符。该方法不但可以扩大对其他蛋白质检测的适用性,而且可以考察蛋白质与其他相关分子的作用情况。 2、基于内含分子信标互补序列的识体探针检测凝血酶 设计了一种新的无需标记的蛋白质识体探针,识体探针由核酸识体和分子信标互补序列两部分直接组成。分别利用分子信标作为报告分子,核酸识体作为识别分子。没有凝血酶存在时,识体探针可以和分子信标最大程度地杂交,使得分子信标的荧光信号上升;当存在凝血酶时,与凝血酶孵育结合后的识体探针再与分子信标作用,分子信标被打开的程度有所降低,并且打开程度的降低程度与凝血酶浓度有关。根据相应的荧光信号变化幅度,可以实现凝血酶的快速、灵敏检测。利用该方法考察了肝素对凝血酶与凝血酶抗体之间相互作用的影响。利用该方法不改变分子信标,仅改变识体探针中识体的类别,即可有望用于其他蛋白质的检测,为蛋白质的研究方法提供了新的途径。 3、基于脱氧核糖核酸聚合反应的识体探针检测凝血酶 发展了一种识体探针设计简单、无须标记,样品信号明显、特异性高的凝血酶检测方法。利用凝血酶异构位点1的核酸识体,结合分子信标的互补序列


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