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一维微流控微珠阵列芯片在核酸检测中的应用

左新兵  
【摘要】: 一维微流控微珠阵列是一个新型的微分离分析平台,它有机地结合了微流控技术、阵列芯片技术以及微珠非均相识别技术。该平台设计灵活、操作简单、试剂消耗量少并可在单一微通道内实现高通量的生物样品并行分析,在生物微分离分析方面具有非常广阔的应用前景。为了进一步开发和拓展一维微流控微珠阵列芯片的应用,使其发展成为一种通用的生物检测平台。本文从一维微流控微珠阵列核酸检测方面着手,以逐步发展高灵敏、操作简单、低成本的核酸检测方法为研究主线,主要开展了以下几方面工作: (1)发展了一种基于固定化分子信标检测原理的多目标核酸检测一维微流控微珠阵列。首先,基于肿瘤相关基因p53、c-myc和cyclin d1的mRNA序列保守区分别设计合成了三种分子信标,并将其修饰到微珠表面,通过显微操作将微珠转移到一维微流控微珠阵列中。通过对微珠修饰条件、微通道修饰方法、缓冲液离子强度、固定化分子信标杂交动力学及对目标选择的特异性等实验条件或影响因素的考察和优化,在一维微流控微珠阵列上实现了对合成的多目标cDNA样品及细胞抽提mRNA的扩增产物的特异性检测。该一维微流控微珠阵列对目标核酸在浓度为0.5 nM到100 nM范围内呈线形响应。固定化分子信标结合一维微流控微珠阵列操作简单、样品体积小、无需样品标记。本实验不仅证实了一维微流控微珠阵列用于进行多目标的核酸检测的可行性,并且为使这一新型的微珠阵列发展成为一种通用型的检测平台迈出了非常重要的一步。 (2)设计了一种可限制性酶切的固定化分子信标用于一维微流控微珠阵列核酸检测。考虑到表面效应对固定化分子信标所带来的负面影响,如设计参数不容易掌握,并通常难于达到理想的荧光恢复效率等问题,在分子信标发夹结构的茎状部分末端增加了延长链以减小表面效应的影响,同时在其环状部分包含一个限制性酶切位点。通过酶切作用可以使信标与目标结合之后,帮助其进一步打开分子信标的发夹结构,提高荧光恢复效率。在本工作中酶切的方法可使分子信标荧光增强倍数从2.7提高到5.2,接近其在溶液中的荧光增强倍数。通过酶切一方面可以在一定程度上提高固定化分子信标的检测灵敏度,另一方面也降低了固定化分子信标的设计要求,即使荧光恢复效率不是很高的固定化分子信标也可得到比较理想的应用,这也为固定化分子信标技术在一维微流控微珠阵列上开展更广泛的应用打下了基础。 (3)发展了一种高灵敏而且无需洗脱的以分子信标作为报告探针的新型三明治结构探针。为进一步提高一维微流控微珠阵列核酸检测的灵敏度,将传统的


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