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淀粉纳米颗粒的制备及其作为抗癌药物/基因载体的研究

肖苏尧  
【摘要】: 纳米技术被广泛地应用于医药领域,特别是在纳米药物载体制备方面取得了长足的进展。但是目前对纳米材料的选择更多集中在合成聚合物上,而天然材料淀粉的应用还很少。本研究采用纳米制备技术,将天然淀粉通过改性,成功制备了阴离子型淀粉纳米颗粒,再以此为主线,对该颗粒进行物理、化学和生物修饰,获得一系列可以作为基因载体、肿瘤靶向载体、抗肿瘤复合药物载体和化学活性药物载体等多种淀粉纳米颗粒,并对这些颗粒作为纳米药物/基因载体的生化特性及其在体内外的抗肿瘤活性进行了深入的探讨,首次系统地研究了淀粉纳米颗粒在抗肿瘤药物载体方面的应用。 该论文的具体研究内容如下: 1.阴离子淀粉纳米颗粒的制备及性能研究阴离子淀粉纳米颗粒的制备:以油相为连续相,将可溶性淀粉水解液作为水相滴加入油相,高速搅拌形成稳定的微乳液体系,再以三氯氧磷作为交联剂,常温下进行交联反应。 阴离子淀粉纳米颗粒的特性:原子力显微镜检测制备的颗粒平均直径为50nm,颗粒均匀、分散性好。Zeta-Sizer粒度仪检测到颗粒的平均电荷为-8.5mv,呈较强负电性。水溶胀性检测表明淀粉颗粒在水溶液中的溶胀能力大大降低,具有较好的水溶液稳定性。颗粒能够高效率地装载在中性溶液中带正电荷的精氨酸,通过药物释放动力学分析表明该颗粒对精氨酸有缓慢释放的作用,在生理盐水中释放持续时间可达48小时以上。阴离子淀粉纳米颗粒主要通过物理吸附和静电结合两种方式结合药物。 2.淀粉纳米基因载体的合成及在乳腺癌细胞中的基因转染 淀粉纳米基因载体的合成:以阴离子淀粉纳米颗粒为内核,经多聚赖氨酸修饰,成功制备获得了多聚赖氨酸淀粉核壳纳米颗粒(PLL-StNPs),在原子力显微镜下检测到这些颗粒的大小为50nm左右,分散均匀。经研究发现PLL-StNPs的主要特性有:(1)有效结合外源DNA。在PLL-StNPs溶液中直接加入质粒DNA,凝胶电泳分析,PLL-StNPs能有效结合DNA。洗脱复合物中的DNA,凝胶电脉分析DNA条带没有改变,说明与PLL-StNPs的结合不改变DNA性质,并能从复合物上有效分离。(2)有效保护外源DNA。结合了DNA的NPs在超声波发生器中处理不同的时间后,洗脱复合物中的DNA,经电泳发现DNA条带没有改变,表明NPs能有效地保护DNA防止超声波的破坏。用DNase I消化DNA-NPs复合物,进行凝胶电泳分析,发现DNA条带均没有改变,实验结果表明DNA-NPs也能较好地保护DNA防止DNaseI的酶切。(3)无细胞毒性:空白颗粒与体外细胞共培养,结果表明该纳米颗粒无细胞毒性。 基因载体的体外细胞转染:PLL-StNPs结合绿色荧光蛋白基因pEGFP,能有效导入体外培养的MCF-7细胞,并在细胞内获得高效表达,转染率达28%左右。通过多次改变N/P的比值进行细胞转染实验,结果表明,以N/P=15的PLL-StNP/pEGFP复合物转染乳腺癌MCF-7传代细胞的转染效果最好。 上述结果表明:PLL-StNPs可以作为一种有效的基因载体。 3.叶酸修饰淀粉纳米药物载体的研制及其肝癌靶向特性分析 叶酸-淀粉纳米药物载体的合成及表征:叶酸活化后先与PEG-(NH2)2结合,得到FA-PEG-NH2,然后将FA-PEG-NH2修饰到淀粉纳米颗粒(StNP)上,从而成功制备获得叶酸-淀粉纳米颗粒(FA-PEG-StNP),经扫描电子显微镜检测其平均直径约为130nm。 FA-PEG-StNP的特性(:1)FA-PEG-StNP的亲水性。将FA-PEG-StNP和FA-StNP分别注射到小鼠的腹腔诱导巨噬细胞,结果显示FA-PEG-StNP诱导出的巨噬细胞数目只有FA-StNP的一半,结果表明FA-PEG-StNP具有更强的亲水性,降低了机体对它的清除能力.(2)FA-PEG-StNP结合药物的缓释作用。与抗癌药物多柔比星(DOX)结合,饱和量为28μg/mg,药物具有明显的缓释现象。(3)FA-PEG-StNP肝癌靶向特性:修饰了荧光物质FITC的FA-PEG-StNP与肝癌细胞和正常肝细胞共培养,在前者细胞中检测到的荧光值是后者的3倍;修饰了荧光物质FITC的FA-PEG-StNP和StNP分别与肝癌细胞共培养,前者的荧光值是后者的4倍,表明修饰叶酸的颗粒具有明显的肝癌细胞靶向的功能。 载药颗粒作用于肝癌细胞:装载抗癌药物阿酶素(DOX)的FA-PEG-StNP与装载DOX的StNP分别在无叶酸培养基中与肝癌细胞BEL7404共培育,结果显示前者的细胞致死率达是后者的2倍,而药物对细胞的半致死浓度是后者的30%左右,说明修饰在颗粒上的FA能显著提高颗粒对肝癌细胞的靶向作用,保持药物的有效浓度,提高了治疗效果。所制备的叶酸-淀粉纳米颗粒具有药物缓释、靶向识别、降低毒副作用的特点,可以作为肿瘤靶向性药物载体。 4.活性硒-淀粉载药复合纳米颗粒的合成及协同作用研究 活性硒-淀粉复合载药纳米颗粒的合成:先将Na2SeO3还原成具有抗氧化活性的红色单质硒,然后将其结合到装有阿霉素(DOX)的淀粉纳米颗粒的表面,形成活性硒-抗肿瘤药物的复合载药纳米颗粒。该颗粒平均直径为70nm,具有明显核壳结构,表面电荷为-13.9mv。 协同作用研究:复合颗粒作用于肝癌BEL7404细胞,其细胞生长抑制率比相当量的红色单质硒与DOX-StNP的细胞抑制率总和高出13%,出现了活性硒与DOX之间的协同效果。协同作用的可能原因为:(1)硒壳层减慢了药物的释放速度,延长了药物的作用时间;(2)红色单质硒的抗自由基活性消除了细胞周围的氧化性物质,一方面降低了肿瘤细胞的分裂速度,另一方面使细胞膜的通透性得到改善,有利于药物进入细胞内部;(3)单质硒晶体表面的负电荷加强了细胞膜的电负性,进一步改善细胞膜的通透性,加强了药物对细胞的抑制作用。 5.双醛淀粉纳米颗粒的制备及作为抗癌药物载体的活体研究 双醛淀粉纳米颗粒的制备、表征及药物装载:以高碘酸钠为氧化剂,将淀粉定点氧化成双醛淀粉,在微乳液体系内,以三氯氧磷作为交联剂,常温下进行交联反应,制备成双醛淀粉纳米颗粒(DASNP)。DASNP的氧化度为(40±5)%,颗粒呈球形,分散性好,粒径分布在80~100nm之间,平均直径为90nm,能溶于碱性水溶液,不溶于酸性水溶液,在pH5~8的范围内,颗粒缓慢溶解。经体外细胞MTT检测和裸鼠活体皮下注射观察发现该颗粒无细胞毒性、无炎症反应,表明其作为药物载体的应用具有安全性保障。抗癌药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)通过亚胺键与双醛淀粉纳米颗粒上的醛基结合,获得5-Fu-DASNPs复合颗粒,研究发现药物装载量约为10%,在pH5~7的溶液中药物释放时间为20h,具有明显缓释现象。 装载药物DASNP对体外细胞作用的检测分析:该载药颗粒对体外肿瘤细胞具有明显的抑制作用,在浓度为1mg/ml时对乳腺癌MCF-7细胞生长抑制率达74.5%,并经流式细胞术检测发现其抑制作用主要发生在细胞周期的G0/G1期。 装载药物DASNP对肿瘤生长抑制的活体研究:将载药颗粒皮下注射到肿瘤周围,其肿瘤抑制率达到75%,其抑制率比单纯药物提高了30%左右。对肿瘤切片进行苏木红染色观察,可见明显的组织细胞凋亡区域;Bcl-2/Bax免疫组化实验结果显示,药物组肿瘤细胞中Bcl-2的表达降低,而Bax的表达明显增多。上述结果表明,载药复合颗粒能高效地抑制肿瘤的生长,而对肿瘤的抑制主要是通过诱导肿瘤细胞的凋亡实现。


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