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核酸探针的设计及其在疾病检测和酶学研究中的应用

孟祥贤  
【摘要】: 目前我们对生命现象的认识和理解已经从个体、组织、细胞层次深入到分子水平,如何从分子水平上实时、原位、灵敏、特异地获取生命过程中的重要信息,一直是生物医学研究者、分析化学研究者不懈努力的目标。核酸探针,一种可以从分子水平上进行设计、标记、合成以及应用的新兴研究手段,为分子生物学和分子医学的发展起了积极的作用。各种设计巧妙、性能优良的核酸探针被开发、研制,并在基因分析、疾病诊断、蛋白质(酶)检测分析、物种分类等领域得到广泛的应用。但是,如何进一步拓展已有核酸探针在生命科学与医学中的应用;如何进一步开发研制新的核酸探针,解决现有探针技术不能解决的问题和在生命研究过程中遇到的新问题,仍然是生物医学工作者面临的严峻挑战,同时也为分析化学加强与生命科学和医学的融合提供了新的机遇。 本论文以上述科学问题为目标,结合分子信标核酸探针和染料探针技术,建立了丙肝病毒核酶切割产物和限制性内切酶切割产物的超灵敏检测方法和简便快捷的地中海贫血遗传病点突变基因分型的方法;建立了体外监测DNA复制过程聚合反应的荧光方法;探讨了生命活动过程中有重要意义的连接酶的连接机理和聚合酶的活性实时分析。更重要的是,开发并研制了三种新型的核酸探针─核酶分子探针、熔点扩大核酸探针和信号扩增核酸探针,用于丙肝病毒核酶切割过程的实时监测和地中海贫血遗传病点突变的检测。主要内容归纳如下: 第一部分分子信标和染料探针技术用于疾病检测和酶学分析 1、建立了核酶切割产物的超灵敏检测方法。核酶是具有切割特定RNA序列能力的小RNA分子,在抗病毒、抗恶性肿瘤基因治疗中有着重要意义。目前核酶切割产物的研究方法,一般需要将核酶或底物RNA进行标记,不利于核酶临床研究与应用。本论文利用分子信标作为核酶切割产物的连接模板和检测分子,在RNA/DNA核酸杂合体连接过程中,核酶切割产物的信息被实时转换为荧光信号。实现了在不标记核酶或RNA底物的情况下,高灵敏高特异地检测丙肝病毒核酶切割产物,检测下限可达0.05 nmol/L。为真实准确反映核酶切割反应提供了一种简便快捷的非同位素分析方法,也为核酶基因药物的快速筛选、核酶动力学、核酶在基因治疗中的深入研究提供了新的思路和技术。 2、建立了限制性内切酶切割产物的超灵敏检测方法。利用分子信标作为限制性内切酶切割产物的连接模板和检测探针,在DNA/DNA核酸杂合体连接过程中,将切割产物的信息实时转换为荧光信号,实现了在不标记限制性内切酶底物的情况下,高灵敏高特异地检测限制性内切酶切割产物。其线性响应范围为0.2 nmol/L到30nmol/L,检测下限可达0.05 nmol/L。该方法不仅可用于限制性内切酶切割产物的检测,还可用于其它水解酶切割产物的检测。 3、建立了DNA连接酶连接机理研究的新方法。核酸连接是生命科学中倍受关注的生命活动。其机理研究有助于进一步拓展核酸连接反应在疾病检测、基因载体及核酸修饰与分析等方面的应用。利用分子信标作为核酸连接的模板和信号产生分子,研究了T4 DNA连接酶的连接机理。为连接酶连接机理及其连接动力学过程研究提供了一种简便快捷的方法。该方法不仅可用于T4 DNA连接酶机理研究,还可用于其它DNA连接酶及RNA连接酶的研究。 4、建立了体外监测DNA复制过程中聚合反应的荧光方法。DNA复制是最基本的生命活动之一,其研究对于探讨生命繁衍、生存与进化问题有重要意义。目前DNA复制的研究,一般采用放射性标记与凝胶电泳相结合的方法,操作复杂,不利于方便快捷地捕获生命活动过程中的重要信息。利用分子信标监测DNA的体外连续复制和不连续复制过程,以荧光信号的方式直接方便地表征出复制过程中聚合反应的有关重要信息,避免了传统的DNA复制分析方法中的放射性同位素标记、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等复杂操作。并利用该体系,建立了三种聚合酶的定量分析方法。 5、建立了简便快速的聚合酶活性实时分析新方法。聚合酶作为生命活动过程中的一种重要的酶,目前已广泛应用于基因测序,载体制备及基因克隆等方面。利用染料探针技术,建立了一种简便快捷地实时监测聚合酶活性的方法,探讨了三种抗肿瘤药物对聚合酶活性的影响,为以聚合酶为作用靶标的抗肿瘤新药的开发及筛选提供了一种新的思路。 6、建立了地中海贫血遗传病点突变检测的简便方法。地中海贫血是一种常见的点突变性遗传病,发展一种操作简便、成本低廉的检测方法对该遗传病的普查及产前诊断有重要意义。基于染料探针技术,结合聚合酶特异性延伸反应,发展了一种简单、快速、成本低的单核苷酸多态性基因分型方法,并用于地中海贫血遗传病点突变的基因分型。 第二部分新型核酸探针的设计及其在疾病检测中的应用 7、核酶分子探针的设计及其对丙肝病毒核酶切割过程的实时监测。核酶切割反应的研究,一直使用传统的放射性同位素标记与变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合的方法,操作繁琐复杂,并且不能实时、动态地提供核酶切割过程的信息。通过将核酶底物修饰,在其两端分别加上6个碱基形成互补臂,构建了一种新的核酶分子探标,它将核酶切割反应的信息实时同步转换为荧光信号,实现了丙肝病毒核酶切割过程的实时监测。与已有研究方法比较,该方法是一种非同位素标记、高灵敏高特异的核酶切割反应实时监测方法。为核酶活性分析、核酶动力学研究提供新型有效的手段,也为核酶基因药物的深入研究提供了新的方法和思路。 8、熔点扩大核酸探针的设计及其在点突变检测中的应用。许多遗传性疾病的发生发展与点突变密切相关,点突变的准确检测对这些疾病的预防、临床检测和分子诊断有重大意义。目前基于熔点分析的方法对于基因型之间有显著差异的点突变,能快速准确的检测,但是对于一些基因型之间熔点差异较小的点突变,不能进行有效判断。基于荧光共振能量转移和连接酶技术,设计了一种新的核酸探针,用于显著提高点突变不同基因型之间的熔点差异,实现了点突变准确快速的基因分型研究。利用该方法,成功实现了地中海贫血遗传病两种普遍存在的点突变CD17 (A→T)和Ivs-2-654 (C→T)的基因分型。该方法能对各种点突变类型进行检测,具有良好的保真性,而且操作简便,不需要离心、电泳、分离等复杂繁琐的步骤,有望在临床检测和应用上发挥重要作用。 9、信号扩增核酸探针的设计及其在点突变检测中的应用。高灵敏的点突变检测方法,目前一般是基于单分子检测系统进行,昂贵的检测装置使其在临床应用受到一定限制。基于微球富集技术与连接酶链式反应扩增技术,发展了一种新的核酸探针来高灵敏、方便快捷的进行点突变检测。样品的基因型通过检测微球上捕获的荧光连接产物方便快速的获得。该方法具有很高的灵敏度,能检测到600个拷贝的靶序列。这种方法,不仅能对PCR扩增产物的点突变进行检测,而且能直接以抽提的总DNA进行点突变检测,再加上其操作简便、成本较低、而且能用于芯片实现高通量检测,该方法在基因突变性疾病的检测中有重要应用前景。


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1 林万明;核酸探针对医学细菌诊断的研究进展[J];解放军预防医学杂志;1989年04期
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