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堆肥化中协同降解木质纤维素的混合菌筛选及其培养

陈耀宁  
【摘要】: 本学位论文以堆肥化过程中木质纤维素降解菌为研究对象,进行了堆肥化过程中纤维素降解菌的筛选,选出其中降解纤维素能力较强的菌株和同样来源于堆肥化中的木质素降解菌在平板上进行了混合培养,进而通过实际降解实验筛选了合适的菌株组合。并以黄孢原毛平革菌为基础,从堆肥中筛选了能与其协同降解木质纤维素的混合菌株,并对混合培养过程中的酶活、木质纤维素降解情况和微生物群落的结构变化进行了考察。结论归纳如下: 利用纤维素琼脂平板、刚果红纤维素琼脂平板和滤纸溃烂筛选室验对堆肥物料中纤维素降解菌进行了分离和纯化,最后从中选取了4株(编号为D、X、P、T)纤维素降解能力较强的菌株。其中菌株X最优,降解纤维素和半纤维效果最好,内切纤维素酶活相对其它菌株升高更快而且更稳定,峰值高达37.07 IU/g。 对6株纤维素降解菌和8株木质素降解菌采用平板混合培养和固态发酵筛选相结合的方法,较快地筛选到了能够提高木质纤维素(稻草)混合生物降解效率的菌株组合,即XP+M5和AF93252+M5。其中XP+M5的混合培养效果最好,半纤维素含量降低到了20.6%,相比XP和M5纯培养时,半纤维素含量分别下降了2.67和3.79个百分点。同时表明对于不同的纤维素和木质素降解菌,简单地将其组合在一起,往往不能获得满意的降解木质纤维素的效果。 在纤维素筛选培养基中加入黄孢原毛平革菌固态发酵的浸提液,能较方便地直接从堆肥中筛选与黄孢原毛平革菌(PC)相容的菌株。筛选出的较优菌株与PC混合培养降解稻草时,对于产纤维素酶,能产生较好的协同效果,并因此产生更好的纤维素降解效果。木质素降解酶系也得到了加强和完善,但对于木素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)的产生,协同作用并不普遍。本研究中木质素降解效率的提高与LiP、MnP和Lac这些常见的胞外酶的变化没有表现出直接的联系,这种提高可能是靠丰富发酵体系内的胞外酶和一些活性因子的种类来实现的。 通过对一株黄孢原毛平革菌和一株歧皱青霉的混合培养,考察了混合培养发酵稻草的过程中产酶和对木质纤维素降解的情况,并利用磷脂脂肪酸(PLFA)和Biolog代谢分析方法研究在发酵过程中不同发酵体系内微生物群落的变化。 研究发现混合培养从很大程度上改变了发酵体系内的产酶情况,所考察的胞外具有木质纤维素降解能力活性酶的变化趋势和大小都发生了改变。其优势主要体现在体系内微生物的产酶更加稳定,峰值维持时间较长。在混合培养条件下Lac优势明显,出现了整个考察过程中的最高值,达到1.28 IU/mL;发酵结束时LiP酶活还处在较高水平52 IU/mL,大约是黄孢纯培养时的两倍,结束时的MnP也比其它纯培养的高。 发酵结束后,混合培养条件下半纤维素、纤维素和木质素的降解率均比纯培养时高,分别为53.1%、52.7%和54.9%。混合培养对发酵过程的优化可能由以下方式来实现:一是改善体系内各种酶组分的活力和稳定性;二是通过丰富混合培养体系内其它与木质纤维素降解有关的小分子活性因子和活性酶的种类来实现;三是上述两种方式同时起作用。 Biolog代谢分析法及PLFA法均能有效鉴别不同体系的微生物多样性和群落结构的变化,可以为混合体系内酶活及降解效果的变化提供更准确的参考信息。Biolog代谢分析中的平均吸光值(AWCD)分析和代谢多样性、丰富度分析都指出混合培养中群落的功能比纯培养黄孢有了改善,但没有超过纯培养歧皱青霉的水平。主成分分析(PCA)表明混合培养体系内的微生物群落结构处于动态变化之中,群落的结构特性在发酵第7天时与黄孢纯培养下的特性更接近,而在发酵结束后则与歧皱青霉的特性更接近。上述结果说明群落的代谢功能很可能不是两种菌株代谢能力的简单加和,此时的代谢能力应当是所混合的菌株相互作用的产物。群落内不同特性的菌株根据环境变化而发生的演替可能是实现混合体系中产酶稳定的原因。 以上系列研究表明,合适菌株组合可以通过混合培养来提高木质纤维素降解效率。使用琼脂平板对菌株之间的相互作用进行初步的研究,有利于混合菌株的筛选,而且通过在筛选平板中加入某菌株的发酵浸提液还可以较方便地筛选到该株菌的相容菌株。这些研究对于以木质纤维素降解菌为主的堆肥复合菌剂的开发提供了很有意义的方法借鉴,有助于解决在菌剂开发中选择菌株缺乏依据的问题,还可以为环境微生物领域中其它使用复合菌体系的优化研究提供参考。在验证复合菌剂效果时,需要对过程中的微生物群落结构的变化进行深入的研究,了解群落的变化对功能带来的影响,才能更好地掌握所研究的复合体系。


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