一维微流控微珠阵列芯片在核酸和蛋白质分析中的应用

【摘要】： 作为一种新型的化学生物微分析技术平台,一维微流控微珠阵列芯片(简称一维芯片)结合了微流控芯片技术、微阵列芯片技术和微珠非均相识别技术的优点。在蛋白质表达以及核酸检测中的初步应用证实了该技术平台在生物研究领域的独特优势。为了拓展一维芯片的应用,并在此基础上进一步完善和提高该芯片在核酸和蛋白质分析中的性能,使其发展成为一种有实用价值的、高灵敏的核酸与蛋白质分析平台,本文开展了以下几个方面的工作。 首先,拓展了一维芯片的应用,将其用于疾病相关基因以及病毒基因的分析,具体包括以下三个部分: (1)发展了一种基于三明治杂交检测原理的多基因转录水平表达一维芯片。根据GenBank中p53、H-ras和NME1三种基因mRNA序列分别设计并合成了三种三明治探针。将捕获探针修饰在二氧化硅微珠表面,采用显微操作系统转移功能化的微珠至微通道小室中,构成一维捕获探针微珠阵列。首先考察了基于三明治杂交法的芯片内DNA合成样品的杂交、检测性能,在此基础上实现了DNA混合样品中多个目标分子的同时检测,进而对细胞提取样品中多个目标基因的mRNA表达水平进行了检测。该一维微流控核酸微珠阵列对目标DNA样品的检测灵敏度为0.02 nM,线性响应范围为0.02-1.0 nM,无需对目标分子进行标记即可实现多目标基因转录水平的表达检测。 (2)一维芯片在肿瘤转移相关基因表达研究中的应用。肿瘤转移是肿瘤病人死亡的主要因素,与肿瘤转移相关基因的表达密切相关。在第一部分工作的基础上,将一维芯片成功地应用于具有不同转移潜能的肿瘤细胞中肿瘤转移相关基因的表达差异研究。选择与肿瘤转移密切相关的三个基因:E-cadherin、mts1和NME1为研究对象,以结肠腺癌原发癌细胞株SW480和转移癌细胞株LoVo以及前列腺癌不转移细胞株PC-3M-2B4和高转移细胞株PC-3M-1E8为研究模型,实现了两组具有不同转移潜能的肿瘤细胞中肿瘤转移相关基因表达谱差异分析。实验结果表明,一维芯片在肿瘤转移相关基因表达研究中的应用对肿瘤的早期诊断、预测和治疗有重要价值。 (3)一维芯片在乙型肝炎病毒基因分型中的应用。不同基因型的乙型肝炎病毒(HBV)之间存在致病性上的差异,同时病毒基因变异可引起抗药性不同的后果,在临床上会表现为漏诊,盲目用药和延误治疗。以中国地区最为常见的B、C、D三种HBV基因型为研究对象,根据GenBank中发表的三种基因型HBV病毒株基因序列,设计合成B、C、D三种基因型特异的基因分型三明治探针,构建了B、C、D基因分型一维芯片。通过摸索和优化杂交、洗脱等实验条件,利用一维芯片平台实现了乙型肝炎病毒B、C、D三种基因型目标DNA序列的准确分型。该HBV基因分型方法简单、快速、准确性高,有望应用于临床HBV基因诊断,为病人的治疗提供帮助。 其次,为进一步提高该芯片平台的性能,发展了基于一维芯片的核酸和蛋白质高灵敏分析方法: (4)发展了一种高灵敏的原位信号放大核酸分析新方法。结合金纳米颗粒与聚合酶催化荧光标记的双重信号放大技术,实现基于一维芯片的高灵敏的核酸分析。该方法对DNA样品的检测下限可达7.0 fM,最低可检测到140个CNE2细胞/μl样品中的p53 mRNA。与前面几部分工作相比,本方法灵敏度提高了3个数量级,而且这种原位信号放大技术适合于在微流控芯片中进行多目标同时检测。这种基于一维芯片的高灵敏核酸分析技术是对该平台的进一步完善和提高,使其在核酸分析领域具有更广泛的应用前景。 (5)发展了一种基于端粒酶信号放大的高灵敏蛋白质检测方法。在本实验室发展的一维蛋白质微珠阵列用于蛋白质表达分析工作的基础上,发展了一种通过核酸信号放大技术实现对蛋白质的高灵敏检测分析方法。利用端粒酶可通过自身RNA模板不断将TTAGGG重复序列添加至端粒酶引物末端的特性,在液相中合成生物素标记的荧光探针,通过生物素-亲和素-生物素交联将荧光探针与生物素标记的一抗结合,实现对目标抗原的高灵敏检测。该方法对p53蛋白的检测下限可达1.0 pM,比一维微珠阵列内双抗体夹心免疫分析法灵敏度提高了近2个数量级,最低可检测到85个CNE2细胞/μl样品中的p53蛋白。利用该方法实现了CNE2细胞和5-Fu处理的CNE2细胞中p53、c-myc、β-actin三种基因的表达差异分析。与免疫PCR和免疫RCA技术相比,本方法简单、快速,可进行高通量平行分析。该方法在一维蛋白质芯片中的应用提高了该蛋白分析平台的灵敏度,对实现基于该平台的低丰度多蛋白检测具有重要意义。 最后,对一维芯片的流体驱动和控制系统进行了改进: (6)设计制作了集成微驱动泵的一维芯片。针对一维芯片采用压力、电渗流或重力进行流体驱动时的缺陷,将基于毛细现象和蒸发作用的微流体驱动泵和一维芯片进行集成。分别考察了环境温度、蒸发面积和相对湿度对微通道中流体速度的影响,并对固定条件下微驱动泵长时间运行的性能进行考察。结果表明,集成于一维芯片中的微驱动泵在普通实验条件下可提供稳定和长时间的流体驱动,通过改变温度和蒸发面积可方便地调节流速,该平台流体驱动和控制性能有明显改善,提高了一维芯片的准确性和重现性,使其更具实用价值。