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根癌农杆菌介导的简青霉H5菌株遗传转化研究

吴康  
【摘要】: 从基因水平来研究丝状真菌对木质素的降解作用具有重要的意义,近年来发展的根癌农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformat ion ATMT)与传统的遗传转化方法相比较,具有高效、稳定、高频单拷贝随机插入、适用范围广等优点,非常适合于丝状真菌的分子遗传学研究。 简青霉(Penicillium simplicissimum)H5是由湖南大学从土壤中分离得到的一株真菌,该菌具有木质纤维素降解活力,但其作用机制和产酶特点尚未得到有效地阐明。本文建立由根癌农杆菌介导的简青霉H5菌株的遗传转化体系,为该菌的功能基因组研究及其基因工程改造提供强有力的工具。 本文将含有潮霉素抗性(Hygromycin Resistance)的载体质粒pBHtl通过冻融法导入根癌农杆菌AGL-1中,与H5孢子共培养两天后筛选得到具有潮霉素抗性的转化子。潮霉素抗性筛选、PCR和Southern blot分子鉴定等结果表明:筛选获得的转化子能够稳定遗传,外源的T-DNA以单拷贝随机整合到简青霉的基因组中。 通过对实验得到的转化子进行刚果红平板脱色实验检测,发现了一株在营养限制培养基上生长状况强于野生型的转化子,而且产纤维素酶的能力也明显高于野生型。转化子在液体培养基中培养7天后,将培养液用硫酸铵沉降并透析纯化所得到的蛋白产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,检测该转化子在液体培养条件下胞外蛋白的总产量。结果发现相同条件下该转化子的胞外蛋白总量高于野生型H5菌株,其中在约30kD处的蛋白含量明显高于野生型H5菌株,对产生这一现象的原因仍需要进一步的研究。


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