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核酸探针与核酸酶结合在分析检测中的应用

薛曹叶  
【摘要】: 核酸探针易于合成、稳定性好、设计简单、信号机制灵活,已广泛应用于生物学、医学和化学等领域。核酸探针与核酸酶结合可以形成多种灵活的分子识别信号转换机制,不仅可以实现高灵敏、高特异性检测,.还用于生物分子相互作用的实时、动态监测。基于此,本文把核酸探针与核酸酶相结合应用于分析检测中,利用核酸探针灵活的信号机制和核酸酶的特异性,具体开展了以下3个方面的工作: 1.基于双链探针和核酸外切酶Ⅰ,发展了一种放大检测小分子的新方法。核酸外切酶Ⅰ只特异性从3'→5'切割DNA单链。首先构建抗核酸外切酶Ⅰ的核酸适体-cDNA双链探针,当有腺苷存在时,通过竞争反应,腺苷与核酸适体结合,双链荧光探针被打开,核酸外切酶Ⅰ可以水解核酸适体和互补DNA暴露的3'-OH端,释放出来的腺苷继续结合另一条核酸适体探针,如此循环,荧光信号不断增强。通过检测酶切反应初速度,实现了小分子腺苷简单、快速的检测。该方法利用没有序列特异性的核酸外切酶Ⅰ进行放大,序列设计简单,对腺苷的检测具有良好的特异性和灵敏度,检测下限为0.65μM,比传统核酸适体双链探针方法的检测下限(26μM)降低了两个数量级,有望发展为一种设计简单、通用的小分子放大检测的方法。 2.基于带AP位点的分子信标,发展了一种APE1酶活性分析的新方法。APE1可以切割带AP位点的DNA。设计了两条分子信标,一条为臂部双链区带有一个AP位点的长臂分子信标(P1),另一条为环部单链区带有一个AP位点的常规分子信标(P2)。把它们作为APE1酶底物,比较了二者的性能。通过检测酶切初速度,用性能更好的P1探针对APE1酶活性进行了分析。该方法结合了APE1的特性和分子信标灵活的信号机制,设计简单,APE1酶的检测下限为0.25 U/mL,线性范围为0.25-50 U/mL,是一种简单的APE1酶活性的分析方法。 3.基于分子信标和S1核酸酶发展了一种检测锌离子的新方法。S1核酸酶是一种单链核酸内切酶,其酶切速度对锌离子有很强的依赖性。使用分子信标作为S1核酸酶的底物,通过检测不同锌离子浓度下酶切初速度的变化,实现了对锌离子简便、快速的检测。该方法利用S1核酸酶的特性和分子信标灵活的信号机制,避免了复杂离子载体的合成,操作简单,对锌离子的检测下限达到120μM。


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