收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

人睾丸生精新基因SPAG4L的初步研究

杨明刚  
【摘要】:在男性不育疾病中,生精障碍及其相关疾病是重要的一个组成部分。许多基因参与了精子生成,成熟,运动等方面的调控。有研究表明,大约2000多个不同的基因参与了男性生殖的各个方面[1,2]:睾丸发育,生殖细胞分化,减数分裂以及精子发生等阶段。其中不少生精相关基因的功能已经被充分研究,但是很大一部分基因的功能如何?与其他的基因怎样相互调控来影响人类生殖的不同阶段尚不完全清楚。因此对人类生精相关基因的研究具有重要意义。 SUN家族是目前研究比较多的一个基因家族。SUN中文全称Sad-1/Unc-84家族。早期在探讨真核细胞的核移动、核重定位、核膜重构等过程中发现,内核膜蛋白Unc-84起到了关键作用[1]。后来又陆续发现部分SUN家族成员参予精子发生过程[3.4]。SUN家族成员的重要结构特征是肽链C端有一个高度保守的SUN domain氨基酸序列,靠近N端有跨膜区(TM),跨膜区和SUN domain之间有coiled-coil区。在人类蛋白中,SUN家族目前已发现的成员有五位:SUN1、SUN2、SUN3、SPAG4(又称SUN 4)和SPAG4L(又称SUN 5或者TSARG4)。 SUN家族成员参予了精子发生过程:在小鼠精子尾部形成过程中,Xueping Shao等发现,SPAG4蛋白通过亮氨酸拉链结构,与Odfl(小鼠精子尾部纤维蛋白)相互作用,在精子尾部发生中起重要作用[3];在哺乳动物精子头部形成过程中,Sun3与外核膜蛋白Nesprin1作用,Sunl与外核膜蛋白Nesprin3作用,将细胞核和细胞质骨架结构联系起来,在确保精子头部形成方面起重要作用[4]。我院中心实验室邢晓为老师在早期研究中,从SPAG4出发,克隆了人类睾丸新基因SPAG4L,并于2001年7月率先向GenBanK提交了该序列(GenBanK登录号:AF401350),随后克隆了SPAG4L的小鼠同源基因spag4l(又名SRG4) (GenBanK登录号:AY307077)。 在早期的动物模型实验中发现,多组织的RT-PCR和Northern blot结果显示人SPAG4L的小鼠同源基因spag4l在小鼠睾丸组织中特异性表达,在其它组织中无明显表达;在研究小鼠同源基因spag4l表达水平变化时发现,RT-PCR结果显示小鼠出生2周内,spag4l表达量极低;3周开始,spag4l开始大量表达;到4-5周时表达量到达最高,说明小鼠同源基因spag4l可能在小鼠精子发育中起重要作用[6]。组织原位杂交结果显示,spag4l在正常小鼠睾丸中大量表达,主要表达于精母细胞和圆形精子细胞中;而在手术隐睾模型中,生殖细胞大量凋亡,精曲小管空泡化,仅在精曲小管管壁残存的生殖细胞中可见个别spag4l棕黄色阳性杂交信号。正常睾丸和隐睾阴性对照中均未见spag4l阳性杂交信号。表明spag4l可能对小鼠精子的生长发育起调控作用。 以上动物实验结果均提示小鼠同源基因spag4l在小鼠的精子发育过程中起重要作用。而对于人类基因SPAG4L基因的功能和特点,目前所知甚少。在本研究中,我们对SPAG4L的蛋白家族归属、时间和空间表达特性;SPAG4L蛋白的原核表达与纯化;亚细胞定位以及SPAG4L蛋白在精子减数分裂发生中的变化等方面进行了初步探讨。 第一章SPAG4L生物学信息学分析和表达特点 目的:研究人睾丸生精新基因SPAG4L与已知的SUN蛋白家族成员的同源性分析,了解其蛋白家族归属;了解SPAG4L的组织表达特异性和时空表达特异性。 方法:将SPAG4L基因全长序列与其他SUN家族成员基因序列比对,进行同源性分析。用Northern blot, RT-PCR,原位杂交等方法对SPAG4L的表达特性进行研究。 结果:SPAG4L是SUN蛋白家族的一个新成员,并且与SUN3,SPAG4来源于同一个祖先。SPAG4L在睾丸组织中特异性表达,而在其余组织中无明显表达,说明其是一个睾丸特异性基因。SPAG4L主要是在成年男性睾丸中高表达,在胎儿睾丸中无表达;SPAG4L蛋白主要表达在精原细胞和精母细胞,在成熟精子中不表达。 结论:SPAG4L是SUN家族的一个新成员;在睾丸组织中特异性表达且与睾丸成熟度有关;SPAG4L蛋白主要在精子发生减数分裂过程早期阶段出现,在成熟精子和长形精子中无表达。为我们进一步深入研究SPAG4L在精子发生机制,在减数分裂中的作用打下一定基础。 第二章SPAG4L的原核表达和纯化 目的:通过构建原核表达质粒PQE-30-SPAG4L,对SPAG4L基因在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化,获得纯化SPAG4L蛋白并进行验证。 方法:取人新鲜睾丸组织,提取总RNA,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增SPAG4L基因编码序列;将该基因克隆到表达载体PQE30中,构建原核表达载体PQE-30-SPAG4L,用限制性内切酶酶切分析及DNA序列分析鉴定重组质粒;将测序验证的重组质粒转化大肠杆菌JM15后诱导原核表达,并用NI-NTA磁性琼脂糖珠对表达出的融合蛋白进行纯化。并用Western Blot法对目的蛋白进行验证。 结果:RT-PCR扩增出SPAG4L的(TSARG4)基因编码序列,目的插入片段长约253bp;产物经限制性内切酶酶切后,成功连接到表达质粒PQE-30。重组质粒PQE-30-SPAG4L经酶切鉴定构建成功;重组质粒转化大肠杆菌JM15后进行诱导并原核表达,获得带有6个组氨酸标签的融合蛋白6×His-SPAG4L。用NI-NTA磁性琼脂糖磁珠纯化6×His-SPAG4L蛋白,并Western Blot鉴定纯化蛋白成功。 结论:成功构建了人睾丸基因SPAG4L (TSARG4)的原核表达载体PQE-30-SPAG4L并体外表达成功;所获得纯化6×His-SPAG4L蛋白可以用于下个阶段,对于SPAG4L蛋白功能学和蛋白相互作用等方面的研究。 第三章SPAG4L的亚细胞定位及其在减数分裂中的变化 目的:研究人SPAG4L蛋白的亚细胞空间定位,并明确对SPAG4L蛋白的精细亚细胞定位起关键作用的结构域。并初步观察人SPAG4L蛋白的小鼠同源基因spag41在小鼠精子减数分裂中的变化。 方法:构建包含不同结构域的EGFP-N1-SPAG4L突变体的表达质粒,转染HeLa细胞,通过激光共聚焦观察绿色荧光蛋白发光情况,了解不同SPAG4L突变体的亚细胞定位情况,观察不同结构域对不同SPAG4L突变体其亚细胞定位变化的影响;用免疫荧光双标的方法,观察其小鼠同源蛋白spag4l和内质网标志蛋白PDI、核膜标志蛋白Lamin B1共定位情况;通过免疫荧光观察其小鼠同源蛋白spag41在小鼠精子减数分裂中的变化并初步分析其意义。 结果:SPAG4L蛋白主要定位于核膜和内质网。其跨膜区(TM)和coiled-coil区对SPAG4L蛋白精确亚细胞定位是必需的,C端的SUN区对SPAG4L蛋白亚细胞定位无影响;在减数分裂中,其小鼠同源蛋白spag4l可能参与了细胞核迁移、定位和核膜重构。 结论:SPAG4L是一个核膜和内质网蛋白;其亚细胞定位依赖于其跨膜区和coiled-coil区,C端的SUN区对其亚细胞定位无影响。其小鼠同源蛋白spag4l参与了减数分裂中核膜的迁移,折叠和重构。提示人SPAG4L蛋白也可能参予人精子减数中核膜的迁移,折叠和重构。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 魏玲;张朝良;蒋磊;杨文理;谢晓砚;覃扬;;人VIGILINN端融合蛋白的表达及亚细胞定位[J];四川大学学报(医学版);2009年02期
2 徐宁;张战锋;黄宪章;陈炜烨;何敏;庄俊华;;PET32a-IL-1RⅠ重组质粒的构建及表达[J];国际检验医学杂志;2011年09期
3 刘进军,李鹏,郭鹰,潘自铁,胡川闽;人源性MIFcDNA的克隆及其原核高效表达的研究[J];第三军医大学学报;2005年10期
4 赵苗;李勃兴;龚芝;严华成;王璞;高天明;;L-型钙通道仪α_(1C)基因片断在大肠杆菌中的谷胱甘肽巯基转移酶融合表达[J];中华神经医学杂志;2007年11期
5 刘岚;兰英华;李用国;;肠出血性大肠埃希菌O157∶H7外膜蛋白A的表达、鉴定和纯化[J];中国病原生物学杂志;2008年07期
6 彭志翔,樊明文,边专,陈智,彭彬;重组质粒pCIA-P在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达研究[J];临床口腔医学杂志;2001年04期
7 王卿;李梅;石立莹;袁立军;王文秀;;副粘病毒Tianjin株NP蛋白的表达及分析[J];中国病原生物学杂志;2008年04期
8 王洪;王友华;曹毅;刘璠;;大鼠PDGF-C基因全长及结构域编码蛋白在大肠杆菌中的表达[J];中国临床医学;2008年06期
9 石玉生;张兴梅;李妍;;表皮生长因子受体胞外区的原核表达和鉴定[J];广东医学;2007年12期
10 刘智敏,陈俊杰,林佳,王若菡,游乐然,东云华;hBDNF基因原核表达重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达[J];生物医学工程学杂志;2001年01期
11 柯叶芳;卢根杰;侯玲玲;吴锐浩;李东;张洪勤;李佩珍;应俊;;3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建和表达[J];中国微生态学杂志;2009年09期
12 苗现伟;刘玺;张改平;席俊;张利娜;刘运超;游雷鸣;赵玉军;;人FcγRⅠ受体胞外区基因的克隆、原核表达及纯化[J];细胞与分子免疫学杂志;2010年02期
13 赵丽晶;王学林;许多;梁作文;滕菲;郭恒;孙树民;赵淑华;赵雪俭;;原核表达HPV16 L1蛋白ELISA方法检测血清抗体[J];中国妇幼保健;2010年35期
14 吴岚晓,李明,王萍,陈白虹;人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达[J];中国生化药物杂志;2002年01期
15 齐建国,周为民,谷淑燕;EB病毒早期蛋白P54的原核表达及其免疫原性的研究[J];生物技术通讯;2003年05期
16 司利钢;刘玺诚;吕有勇;王根宇;李文梅;姜英;;人抗菌肽hCAP18全长cDNA克隆及原核表达[J];免疫学杂志;2006年03期
17 刘艳君;罗冰;赵文忠;朱平;富宁;;人TLR-2胞外肽段的分段表达及其活性鉴定[J];现代免疫学;2006年04期
18 吴东林;王慧;沈博;扈光伟;侯祥;;普马拉病毒核蛋白基因片段原核表达及产物纯化[J];中国卫生工程学;2010年01期
19 李金福;陈建平;田玉;马莹;胡孝素;;杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因原核表达重组质粒的构建[J];贵阳医学院学报;2011年02期
20 陈宏翔;林能兴;黄长征;李家文;刘厚君;涂亚庭;;淋病奈瑟菌mtrC膜蛋白基因的克隆和表达[J];中华皮肤科杂志;2005年11期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 杨光;盛清;张耀洲;;家蚕Y-Box蛋白的克隆表达以及功能分析[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2009年学术交流会论文摘要汇编[C];2009年
2 焦石;贾立军;薛书江;刘明明;黄国明;张守发;;牛源犬新孢子虫MAG1基因的克隆及原核表达[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
3 孟先明;潘艳;蔡新斌;陆专灵;梁湘;唐海波;杨剑;张红普;罗廷荣;;狂犬病毒ERA株基质蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备[A];2010全国狂犬病防控高层论坛论文集[C];2010年
4 赵刚;李刚;范晓娟;;狂犬病病毒P基因的原核表达及间接ELISA方法的应用[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第二次学术研讨会论文集[C];2010年
5 辛英豪;高继明;刘标;李莎莎;姜世金;;Ⅰ型鸭病毒性肝炎VP1基因的克隆与原核表达[A];山东畜牧兽医学会禽病学专业委员会第一次学术研讨会论文集[C];2009年
6 覃烨;许强华;;盐度胁迫下三疣梭子蟹热休克蛋白HSP90a的原核表达[A];渔业科技创新与发展方式转变——2011年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
7 吴斌;肇慧君;王长文;张秀云;;猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备与鉴定[A];动物检疫学分会2010年学术年会论文集[C];2010年
8 路立婷;程安春;汪铭书;蒋金凤;朱德康;贾仁勇;罗启慧;陈孝跃;;鸭瘟病毒UL46基因主要抗原域的克隆、原核表达及其产物的抗原性分析[A];第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛论文集(下册)[C];2010年
9 罗丹丹;程安春;汪铭书;;鸭瘟病毒UL47基因主要抗原域的原核表达及抗体制备[A];第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛论文集(下册)[C];2010年
10 宋艳;柳学广;朱晓苏;徐丽;司马杨虎;徐世清;;野桑蚕Bmand-Sxl基因的克隆及原核表达[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(1)[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 杨明刚;人睾丸生精新基因SPAG4L的初步研究[D];中南大学;2011年
2 黄小波;猪传染性胃肠炎检测基因芯片与猪传染性胃肠炎病毒SC-H株N基因表达研究[D];四川农业大学;2006年
3 韩春来;鸡干扰素与干扰素受体重组蛋白的生物学特性及其相互作用[D];中国农业大学;2005年
4 张付云;壳寡糖诱导烟草抗性相关基因的克隆和鉴定[D];中国科学院研究生院(大连化学物理研究所);2007年
5 梅素玉;基于机器学习的蛋白亚细胞定位预测[D];复旦大学;2010年
6 戴银;鸡MHCⅠ类分子结构与抗病性关系的研究[D];安徽农业大学;2010年
7 陈立志;牛源致病性坏死梭杆菌分离鉴定及其白细胞毒素免疫特性研究[D];吉林大学;2008年
8 赵宇军;猪戊型肝炎病毒结构蛋白基因表达及其基因特异性噬菌体展示肽库构建[D];中国农业科学院;2005年
9 韩俊友;牛蛙皮肤抗菌肽分离纯化、基因克隆表达及生物学特性的研究[D];吉林大学;2007年
10 李静;海洋酵母菌Metschnikowia reukaufii W6b酸性蛋白酶的生产、基因克隆和表达的研究[D];中国海洋大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李会娟;家蚕转胶蛋白基因的原核表达及功能的初步研究[D];浙江理工大学;2010年
2 葛红秀;家蚕钙磷蛋白(BmCAPS)的原核表达及定位分析[D];浙江理工大学;2010年
3 刘静;家蚕BmycaCR基因的原核表达和亚细胞定位研究[D];浙江理工大学;2010年
4 刘广强;家蚕Ras oncoprotein(Bras1)基因的原核表达及功能分析[D];浙江理工大学;2010年
5 丁彪;小鼠IFRG15基因在植入前胚胎及原核表达的研究[D];安徽农业大学;2010年
6 焦健;食品中潜在环境内分泌干扰物的受体通道研究[D];河南工业大学;2010年
7 刘颖硕;家蚕BmE(spl)-like基因的原核表达、亚细胞定位及功能分析[D];浙江理工大学;2010年
8 王沛珍;Thanatin的原核表达、纯化及其抗菌活性的检测[D];南方医科大学;2010年
9 霍锦霞;家蚕squid基因的原核表达和定位分析[D];浙江理工大学;2010年
10 赵秀新;牛消化道Ⅰ型肽载体(bPepTⅠ)部分序列的克隆、表达及多克隆抗体的制备[D];山东农业大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 冯卫东;抑制蛋白相互作用可成为治癌新方法[N];科技日报;2009年
2 张佳星;人类为何如此与众不同[N];科技日报;2008年
3 吴一福;我学者首次发现抗HBV末端蛋白杂交瘤细胞系[N];中国医药报;2006年
4 唐伟;生物膜研究领域的新收获[N];科技日报;2006年
5 记者 耿建扩 蔺玉堂;“表达凝血八因子新的重组质粒”成功研制[N];光明日报;2006年
6 严少慰;查游离DNA 肺癌有望早发现[N];健康报;2008年
7 冯卫东;生物钟与新陈代谢分子关联查明[N];科技日报;2008年
8 江南烟雨;病毒是啥样子[N];大众卫生报;2005年
9 新华社;日专家发现“中间型”微生物[N];光明日报;2006年
10 胡德荣;蛋白质相互作用网络预测新方法被发现[N];健康报;2007年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978