糖尿病人群及高脂饮食肥胖小鼠的免疫代谢学研究

【摘要】：第一部分肥胖与自身免疫糖尿病的临床流行病学调查 目的：研究成人迟发型自身免疫糖尿病(LADA)在中国初诊2型糖尿病患者中的患病率；研究肥胖在自身免疫糖尿病患者中的患病率。 实验设计：多中心、横断面、病例对照研究。 方法：全国46家三级甲等医院入组有效新诊2型糖尿病患者共计5128例,其中确诊LADA患者316例；湖南省各省地市级医院入组1型糖尿病患者共计109名；社区流调OGTT筛选健康正常对照216；均于当地医院采集人口学及一般临床资料,血清送中南大学糖尿病中心检测GADA。 结果：①5128例新诊2型糖尿病患者中,316[6.2%(5.5-6.8)]名患者GADA为阳性,诊断为LADA。②LADA北方患病率高于南方6.9%(156/2256)v.s.5.6%(160/2872),校正后差异具有统计学意义(P=0.018)。③患者按15岁为年龄段划分亚组,GADA的阳性率随着年龄的增长而降低。校正后,差异仍然具有显著性(P=0.004)。在15～29岁年龄组,GADA阳性率最高达11.7%(29/248),是阳性率最低的45～59岁年龄组[5.0%(110/2207)]的两倍。④新诊的2型糖尿病患者按BMI划分亚组,体型消瘦的患者GADA阳性率更高(P0.001)。校正后,差异仍然具有统计学意义。⑤新诊2型糖尿病患者根据空腹C肽水平分为胰岛β细胞功能差组(0.3ng/ml)和较好组(≥0.3ng/ml)。胰岛功能差组GADA阳性率明显高于胰岛功能较好组[12.6%(39/309)Vs.5.4%(80/1479),P0.001],校正后差异仍然具有统计学意义(P=0.001)。⑥2型糖尿病患者中超重及肥胖患者共计2148例,患病率为44.99%；而经典1型糖尿病患者中超重及肥胖患者共计8例,约占8.25%；肥胖在LADA患者中发病率介于1型和2型糖尿病之间,共计108例,约占34.50%,与健康对照患者近似(33.18%)。四组间,或两两组间比较各类型体型人群所占比例,P值均小于0.001。⑦男性2型糖尿病患者中,肥胖及超重患者共计1365例,约占47.7%；而在男性1型糖尿病患者中,肥胖及超重患者共计6例,约占9.23%;LADA介于其中,共有73例肥胖或超重患者,约占37.44%,略低于健康对照组的40.14%。四组间,或两两组间比较各类型体型人群所占比例,P值均小于0.00l。⑧健康对照及2型糖尿病患者中,超重及肥胖患者所占比例随年龄的增加逐渐降低,而在1型糖尿病患者中逐渐增加。LADA患者中,肥胖及超重患者所占比例先随增龄而增加,继之持平。⑨在2型糖尿病及LADA患者中,肥胖组较非肥胖组具有更好的胰岛功能。 结论：LADA在初诊2型糖尿病中占6.2%,肥胖及超重患者在LADA中占34.5%,在1型糖尿病患者中占8.25%。从流行病学角度,2型糖尿病相关的炎症(肥胖)及1型糖尿病相关的自身免疫反应(胰岛自身抗体)同时存在于同一类型病人。糖尿病可能存在共同的免疫学机制。 第二部分炎症及脂肪细胞因子在不同糖尿病人群中的水平及相关临床特征研究 目的：血清细胞因子水平的改变多见于肥胖及2型糖尿病患者,在自身免疫糖尿病中尚未详尽研究。我们检测中国糖尿病患者血清炎症因子或脂肪细胞因子水平以研究其与糖尿病特别是自身免疫糖尿病的关系。 设计：多中心、横断面、病例对照研究。 方法：由来自第一部分研究的多中心人群中选取30岁以上符合入组及排除标准的的健康对照196名,1型糖尿病53名,LADA 250名,以及2型糖尿病285名。中心化检测血清中的hs-CRP, IL-6, LCN2以及Adiponectin水平,并分析相关临床特征。 结果：①与LADA及2型糖尿病患者相比,1型糖尿病患者具有年龄小(40.77±9.89yrs),体型偏瘦(BMI=21.94±5.19kg/m2)的临床特征。LADA的胰岛功能(fasting insulin:8.9±0.56μUml, FCP:1.51±0.12 vs.1.03±0.10 nmol/1, P0.01)比2型糖尿病差,而1型糖尿病患者胰岛功能(FCP:0.27±0.07 nmol/1)比LADA及2型糖尿病患者都更差(FCP:1.03±0.10 and 1.5±0.12 nmol/1 respectively, P0.01 for each)。②校正后,与正常对照组比较(1.82±0.11 pg/ml),所有糖尿病组IL-6均升高(T1DM:3.05±0.50, LADA:3.04±0.24, T2DM:4.03±0.33 pg/ml, P0.01 for each)。同时LCN2在各糖尿病组中(67.01±13.01, 65.98±5.39,81.80±6.10 pg/ml respectively)较正常对照组也增加(28.43±1.22 pg/ml, P0.01 for each)。③所有四种细胞因子在LADA中(包括hs-CRP2.30±0.14mg/l以及Adiponectin8.76±0.75 ug/ml)较正常对照组(hs-CRP:1.36±0.12 mg/l, Adiponectin:8.15±0.40 ug/ml, P0.01 for all)都升高。④在1型糖尿病组中,adiponectin较正常对照组升高(12.91±1.74 vs.8.15±0.40 ug/ml, P0.01),但hs-CRP没有统计学差异(1.18±0.24 vs.1.36±0.12 mg/1)。⑤在2型糖尿病中,hs-CRP较正常对照组增加(2.47±0.13 vs.1.36±0.12 mg/ml, P0.001),但adiponectin反而减少(5.95±0.33 vs.8.15±0.40ug/l, P0.001)。⑥对于所有的糖尿病患者,GADA的滴度与adiponectin的水平正相关(r=0.14,P0.01)并与hs-CRP负相关(r=-0.15,p0.001)。⑦在所有的研究对象中,WHR, FPG,以及HOMA-β都与IL-6, LCN2, and hs-CRP相关,并且这三种细胞因子相互之间都相关(p0.01 for each)。 结论：在中国人群中,炎症标志物在所有三种糖尿病患者中都升高,但是其病因机制可能不尽相同。 第三部分CD11 c+细胞表达MYD88蛋白正向调节高脂诱导的肥胖的形成 目的：通过高脂饲养,建立肥胖小鼠模型,比较不同基因型小鼠通过高脂喂养4个月后的肥胖表型。 方法：B6野生型小鼠,B6Myd88-/-小鼠,以及B6CD11cMyd88+/+ Myd88-/-小鼠,分为高脂食物饲养组和普通食物饲养组(每组均大于10只),自6周龄起开始4个月高脂饲养。监测小鼠体重,食物消耗量。IPGTT,ITT检测小鼠葡萄糖及胰岛素耐受情况。称量小鼠附睾脂肪垫重量,全身扫描确定小鼠体脂含量。测定小鼠血清甘油三酯(TG)及高密度脂蛋白水平。测定小鼠骨密度。 结果：1)通过高脂饲养小鼠成功建立高脂致肥胖小鼠模型。经过4个月高脂食物喂养,野生型小鼠平均体重达到47.35g,而普通饮食组平均体重仅29.60g,P0.001。2)全身MyD88-/-基因敲除小鼠经高脂饲养,体重显著低于野生型小鼠。高脂饮食MyD88-/-小鼠平均体重为40.64g,轻于B6野生型小鼠(47.35g,P0.001)。3)B6CD11 cMyd88+ Myd88-/-小鼠CD11c细胞表达MyD88分子而其他所有组织及细胞均不表达。经过高脂饲养4个月,其体重与B6野生型小鼠相似,重于全身MyD88-/-小鼠。4)B6野生型小鼠每周摄取能量远高于Myd88-/-小鼠。CD11cMyd88+ Myd88-/-小鼠摄取食物能量介于二者之间。5)与体重趋势一致,附睾脂肪垫,全身体脂扫描均显示MyD88-/-小鼠体脂含量低于B6野生型小鼠,CD11cMyd88+ Myd88-/-小鼠介于二者之间。6)IPGTT结果,特别是曲线下面积结果显示MyD88-/-小鼠的葡萄糖耐量最佳。CD11cMyd88+ Myd88-/-小鼠次之,B6最差。(P0.001over all)7)ITT结果,特别是曲线下面积结果显示MyD88-/-小鼠的胰岛素耐量最佳。CD11cMyd88+ Myd88-/-小鼠次之,B6最差。但统计学差异仅见于高脂和普通饮食组之间。8)血脂检测显示甘油三酯水平在MyD88-/-小鼠中显著降低,CD11cMyd88+Myd88-/-小鼠介于两者之间。(P0.001 overall)高密度脂蛋白水平未见明显差异。9)骨密度水平无明显差异。 结论：4个月高脂饲养可以成功建立肥胖小鼠模型。MyD88分子全身敲除有效保护肥胖的形成。CD11c细胞表达MyD88分子可以正向调节肥胖的形成。三种小鼠高脂饲养后脂肪分布,葡萄糖耐量及甘油三酯水平具有明显差异。 第四部分高脂饮食下B6, MyD88-/-,以及CD11cMYD88+/+ MYD88-/- B6肥胖小鼠的免疫学研究 目的：比较三种不同基因型小鼠在高脂饲养致肥胖后的脾脏淋巴细胞、脂肪基质细胞、骨髓分化树突状细胞及肠道淋巴系统的免疫改变。 设计：B6野生型小鼠,B6Myd88-/-小鼠,以及B6CD11cMyd88+/+ Myd88-/-小鼠,分为高脂食物饲养组和普通食物饲养组,自6周龄起开始4个月高脂饲养。 方法：获取小鼠的脾脏淋巴细胞、脂肪基质细胞、骨髓分化树突状细胞及肠道淋巴细胞。通过免疫荧光单克隆抗体进行染色,流式细胞术测定各类免疫细胞的表型变化。通过细胞内因子染色,流式细胞术测定调节性T细胞的变化。通过Luminex检测平台,检测血浆中游离炎症因子的变化。通过细胞内因子染色,流式细胞术检测各细胞群细胞因子释放的变化。通过3H掺入法检测脾脏淋巴细胞对于CD3, CD40,LPS的刺激的变化。磁珠分离CD11c+细胞,通过与BDC2.5T细胞共培养,3H掺入法测定其抗原提呈功能。 结果：1)野生型B6小鼠各类免疫细胞所占比例特别是T细胞所占比例均显著下降。高脂饮食下,脂肪基质细胞中的CD4+及CD8+T细胞所占比例减少,而CD11b+及CD11c+细胞所占比例增加。高脂饮食下MyD88-/-小鼠的脾脏淋巴细胞中CD11c及CD11b细胞较其他两组增加,而在脂肪基质细胞中较其他两组小鼠减少。2)Foxp3调节性T细胞以Foxp3+CD25-CD4+细胞为主,Foxp3+CD25+CD4+细胞所占比例小于前者。无论高脂或是普通饮食,淋巴细胞Foxp3+CD25+CD4+在MyD88-/-小鼠中所占比例高于其他两组小鼠而Foxp3+CD25-CD4+细胞所占比例低于其他两组小鼠。在脂肪基质细胞中,两类调节性T细胞均自B6、MyD88-/-、到CDllc小鼠逐渐增加。3)高脂诱导肥胖小鼠游离炎症因子较普通饮食小鼠显著增加。4)高脂饮食下MyD88-/-小鼠在LPS刺激下较其他两组无明显增殖。5)纯化的CDllc细胞在不同浓度抗原刺激下抗原提呈功能在三组小鼠中有所不同,低浓度时,B6小鼠CDllc细胞具有最好的抗原提呈功能,而高浓度抗原刺激下则低于MyD88-/-及CDllc小鼠。6)MyD88-/- B6小鼠BMDC的抗原提呈功能优于B6及CD11cMyD88+/+MyD88-/-小鼠。7)高脂饮食影响肠道淋巴系统的细胞表型,在MLN和PP中,MyD88-/-小鼠各类淋巴细胞亚群所占比例均增加。CD103肠道归巢标志物在脾脏淋巴细胞中的CD4及CDllc细胞中的表达在MyD88-/-小鼠中增加。高脂影响下,细胞因子TNFα及IL10的改变与普通饮食组存在差异。 结论：高脂饲养致肥胖小鼠免疫细胞亚群表型在各器官和组织中存在显著差异。MyD88-/-小鼠与野生型B6小鼠免疫系统存在差异,CD11cMyD88+/+MyD88-/-小鼠免疫变化与野生型相似。免疫系统的各类变化可能是MyD88-/-小鼠高脂饲养下无肥胖表型的原因之一。