银屑病皮损及缺氧条件下HaCaT细胞HIF-1α与血管生成相关蛋白表达关系的研究

【摘要】：银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病,其组织病理学改变以角质形成细胞过度增殖、新生血管形成、炎症细胞浸润为基本特征。目前认为银屑病组织病理学改变的三大基本特征之间的关系密不可分,其中新生血管形成可能启动了整个病理变化过程。目前对银屑病的血管生成机制的研究已成为热点,特别是一些血管生成相关因子日益受到重视。角质形成细胞是促血管生成因子的主要来源之一,可分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、转化生长因子-α(transforming growth factor-α, TGF-α)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGF)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis facto-α, TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、内皮细胞促血管生成因子、胸苷磷酸化酶和白介素-8 (interleukin-8, IL-8)等。其中VEGF是目前发现的作用最强、最专一的直接促进血管生成的因子之一；iNOS则通过诱导生成NO,发挥促进血管生成等作用。 微血管是皮肤组织与循环血液进行物质交换的场所,当组织增生或其他因素超过了血管供应能力时,就将导致组织缺氧,这时机体感受02浓度变化并对缺氧做出适应性反应,用以维持组织氧供并增强细胞在缺氧情况下的适应能力,其中最重要的低氧信号传递因子就是低氧诱导因子-1 (hypoxia- inducible factor 1, HIF-1), HIF-1是低氧时诱导基因表达和恢复细胞内环境稳定的一个核心调节因子。缺氧条件下,细胞产生的HIF-1与靶基因中的低氧反应元件(hypoxia response elemet, HRE)结合并促进靶基因转录,引起一系列细胞对缺氧的适应性反应,对保持机体的氧稳态,具有重要的病理生理学意义。 最新的一些研究发现,缺氧可能参与银屑病的发生与发展。HIF-1α是调节HIF-1活性的功能亚单位,在缺氧条件下,它稳定存在并诱导如VEGF和iNOS等靶基因的表达。因此,我们推测在银屑病中是否存在缺氧诱导了HIF-1α的表达,进而调控一些与血管生成相关靶基因如：VEGF和iNOS的表达并参与银屑病的新生血管形成,从而在银屑病的发生、发展过程起着重要作用。我们拟通过三个部分的研究来证实：1.银屑病皮损中HIF-1α与血管生成相关蛋白表达的关系；2.低氧培养HaCaT细胞中HIF-1α与血管生成相关蛋白表达的关系；3.抑制HIF-1α的表达对低氧条件下培养HaCaT细胞血管生成相关蛋白表达的影响。通过这些研究试图揭示HIF-1α在银屑病的新生血管形成机制中的作用,并为银屑病的治疗寻找有效的新途径提供理论依据。 第一部分银屑病皮损中HIF-1α与血管生成相关蛋白的表达 目的探讨HIF-1α、VEGF、iNOS在进行期寻常型银屑病皮损及非皮损中的表达,并分析它们的相关性,同时分析其与银屑病血管增生的相关性。 方法采用免疫组织化学SABC法和蛋白印迹法检测32例进行期寻常型银屑病患者皮损组织、非皮损组织和20例正常人皮肤组织中HIF-1α、VEGF和iNOS的蛋白表达水平,并采用图像分析技术对其表达进行定量分析,同时用CD34标记血管内皮细胞,计算皮肤组织中的微血管密度(MVD)。 结果银屑病患者皮损组织中HIF-1α、EGF和iNOS蛋白表达的平均积分吸光度值分别为86.96±2.56、95.81±2.74、90.01±2.77,MVD为33.80±4.15；非皮损组织中HIF-1α、EGF和iNOS蛋白表达的平均积分吸光度值分别为30.14±7.77、44.32±9.06、48.76±10.08,MVD为17.16±3.54；正常人皮肤组织中HIF-1α、VEGF和iNOS蛋白表达的平均积分吸光度值分别为29.15±7.08、34.±13.82、37.33±3.13,MVD为18.48±3.67。经统计学分析,银屑病患者组皮损组织中三者的表达与MVD均高于非皮损组织和正常人皮肤组织(P0.01),而银屑病患者非皮损组织与正常人皮肤组织相比,差异无显著性(P0.05)。银屑病患者组皮损组织中HIF-1α、VEGF和iNOS三者蛋白的表达均与MVD呈显著正相关(r=0.947, P0.01；r=0.859, P0.01；r=0.899,p0.01)；银屑病患者组皮损组织中HIF-1α蛋白的表达与VEGF及iNOS蛋白的表达亦呈明显正相关(r=0.817, p0.01；r=0.873, p0.01)；蛋白印迹法检测银屑病患者组皮损组织中HIF-1α、VEGF和iNOS三者蛋白表达的平均值分别为0.76±0.068、1.21±0.131、0.96±0.045,非皮损组织中HIF-1α、VEGF和iNOS三者蛋白表达的平均值分别为0.42±0.081、0.78±0.062、0.44±0.046,20例正常对照者皮肤组织中HIF-1α、VEGF和iNOS三者蛋白表达的平均值分别为0.32±0.093、0.73±0.098、0.43±0.098。上述结果显示银屑病患者皮损组织中HIF-1α、VEGF和iNOS三者蛋白的表达水平均显著高于正常对照组(p均0.01),而非皮损组织中HIF-1α、VEGF和iNOS三者蛋白的表达水平与正常对照组比较无统计学差异(p均0.05),与免疫组织化学检测结果一致。 结论进行期寻常型银屑病皮损组织中存在HIF-1α、VEGF和iNOS蛋白的过表达,三者在促进银屑病新生血管生成中具有协同作用,可能在银屑病的发生、发展过程中起到重要作用。 第二部分缺氧条件下HaCaT细胞HIF-1α与血管生成相关蛋白表达的研究 目的研究缺氧条件下角质形成细胞株HaCaT细胞内HIF-1α、VEGF和iNOS的mRNA及蛋白的表达。 方法分别在常氧和低氧条件下培养HaCaT细胞,培养4、8、12、24h后,收集细胞,提取细胞总RNA和蛋白,采用实时定量逆转录-聚合酶链反应(real time RT-PCR)及Western blot技术检测各组HaCaT细胞中HIF-1α、VEGF和iNOS的mRNA及蛋白表达水平。 结果低氧条件下与常氧条件下培养HaCaT细胞的HIF-1αmRNA表达水平比较无统计学差异(P0.05),但HIF-1α蛋白表达水平在低氧条件下较常氧条件下有显著增高(p0.01)。低氧条件下与常氧条件下培养HaCaT细胞的VEGF、iNOSmRNA和蛋白表达水平比较均显著增高(p0.01)。 结论1)低氧对HaCaT细胞HIF-1αmRNA的表达调控无明显作用,但使HIF-1α蛋白的表达明显上调。2)低氧对HaCaT细胞的VEGF及iNOS mRNA和蛋白的表达水平明显上调。 第三部分HIF-1α小干扰RNA对HaCaT细胞血管生成相关蛋白表达的影响 目的探讨HIF-1α-siRNA对低氧条件下培养HaCaT细胞的HIF-1α、VEGF和iNOSmRNA及蛋白表达水平的影响。 方法设计并合成针对HIF-1α的特异性小干扰RNA,通过脂质体Lipofectamine 2000介导HIF-1α-siRNA转染HaCaT细胞,同时设转染对照组,分别在低氧状态下培养24h后,提取细胞总RNA和蛋白,采用real time RT-PCR和Western-blot方法检测HIF-1α、VEGF和iNOS mRNA及蛋白表达水平的变化。 结果转染HIF-1α-siRNA的HaCaT细胞低氧培养24h后,HIF-1α、VEGF和iNOSmRNA及蛋白的表达水平均较对照组显著降低。 结论抑制低氧条件下培养HaCaT细胞HIF- 1α的表达可显著下调VEGF和iNOS mRNA及蛋白的表达,推测低氧状态下HaCaT细胞中VEGF和iNOS的表达受HIF-1的调控。