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鼻咽癌血清肽差异表达模式及血清miRNA分子标志物筛选

曾希  
【摘要】:背景:恶性肿瘤难以治愈的主要原因是早期不容易被发现,一旦出现明显症状就诊,大多数已经到中晚期,伴有较广泛的浸润或转移,临床治疗效果差。目前,最佳抗肿瘤治疗策略仍然有赖于早期发现及密切监测早期复发。寻找方便有效的肿瘤早期诊断分子标志物和方法,一直是肿瘤研究亟待解决的问题。血液天然反映着机体的生理和病理状态,且血液标本较易获取,是寻找疾病分子标志物最理想的材料。鼻咽癌在欧美等西方国家罕见,而在我国高发,鼻咽癌也被形象的称为“中国癌”。鼻咽癌发病隐秘,早期没有明显临床表现,不容易发现,且鼻咽癌淋巴结转移发生早。因此,鼻咽癌早期诊断在我国尤为重要。由于鼻咽癌与EB病毒感染存在一定相关性,目前,临床上针对鼻咽癌的筛查主要是检测血液中EB病毒感染情况,如EBV-DNA、EBV-VCA-IgA等检测。但鼻咽癌与EBV并非完全相关,且许多疾病(如淋巴瘤、胃癌、乳腺癌、咽炎、传染性单核细胞增多症等)都可伴有EBV感染,健康人群也有一定比例感染者,大量的临床实践证明,EBV相关检测诊断鼻咽癌的灵敏度与特异性都不高,达不到作为早期诊断标志物的要求。肿瘤本身就是组织微环境的产物,肿瘤与微环境之间相互影响,组织微环境的多肽成分可以进入血液循环。血清中包含大量的低分子肽,这些肽受到机体生理和病理状态的影响,天然的“记录”着机体的生理和病理信息。因此,血清肽很可能是进行疾病血液学诊断的良好资源,昔日认为是生物垃圾的血清肽如今成了“诊断黄金”。在多种肿瘤中,血清肽的研究也正在兴起。miRNA是一种非编码小RNA,在基因的转录后调控中发挥巨大作用。miRNA的异常表达在许多疾病中扮演重要角色,特别是在肿瘤性疾病中,miRNA的意义尤其重要。近年来的研究发现,血清中存在miRNA,血清(?)niRNA的表达受疾病的影响,且这些miRNA十分稳定,具有成为疾病标志物的天然优势,是十分有应用前景的疾病诊断标志物。 目的:本研究拟通过对鼻咽癌患者血清和非癌人群血清的血清肽谱和血清miRNA表达谱进行比较研究,经过筛选、验证,寻找差异表达血清肽(表达模式)和血清miRNA,并建立鼻咽癌血清肽和血清miRNA诊断模型或判别方程,为鼻咽癌早期诊断、病情监测和预后提供实验依据,并可能为治疗提供思路和靶点。 方法:1.制定血清采集的标准程序按照标准程序广泛收集鼻咽癌患者(包括治疗前、一个疗程后)血清和非癌人群血清标本,完善基本资料和相关临床资料,建立血清样本库;2.使用EBV-VCA-IgA ELISA检测试剂盒检测所有血清标本中EBV的感染情况;3.运用WCX磁珠固相分离与MALDI-TOF质谱技术相结合的方法,获得鼻咽癌血清肽谱和非癌血清肽谱,对其二组血清肽谱进行比较研究,使用Clinpro Tools软件和CARS (competitive adaptive reweighted sampling)算法建立鼻咽癌血清肽诊断模型(判别方程),同时观察不同临床阶段鼻咽癌血清肽谱和鼻咽癌治疗前后血清肽变化情况;通过随访,分析血清肽表达模式与预后的关系;4.通过TaqMan Low-Density array (TLDA) miRNA芯片获取鼻咽癌患者血清和非癌人群血清的miRNA表达谱,通过比较分析和定量PCR验证筛选鼻咽癌差异表达血清miRNA;建立鼻咽癌血清miRNA诊断模型,并验证诊断模型的诊断效率;随访患者,采用Kaplan-Meier法分析鼻咽癌差异表达血清miRNA与预后的相关性。 结果:1.收集了一定量的鼻咽癌血清样本和非癌血清样本,初步建立了资料齐全的血清样本库;2.通过EBV-VCA-IgA检测得到非癌血清样本EBV阳性率为11.4%,鼻咽癌患者血清样本EBV阳性率为66.2%,差异有高度显著性。3.在正式实验前,通过磁珠-质谱实验条件摸索,发现了一系列影响结果的实验条件,制订了合理可靠的磁珠-质谱方法实验流程;4.通过不同年龄段和不同性别血清肽的比较研究,发现年龄对血清肽谱有较大影响,性别对血清肽谱的影响相对较小;5.获得了基于WCX磁珠和MALDI-TOF质谱技术的鼻咽癌血清肽谱和非癌人群血清肽谱。6.使用Clinpro Tools建立鼻咽癌血清肽诊断模型,外部验证其特异性为85.7%、灵敏度为80.7%;7.运用CARS算法建立鼻咽癌的诊断判别方程:Y=0.2884X1+0.2073X2-0.2223 X3+0.3985 X4+0.2446 X5(X1:1741.10Da;X2:2991.11Da;X3:3192.36Da;X4:3890.71Da;X5:5064.67Da),其特异性为84.08%,灵敏度为93.50%,曲线下面积(AUC)为0.9425;8.通过对不同临床阶段鼻咽癌血清肽谱的比较分析发现,血清肽的改变主要发生在正常-早期鼻咽癌过程中,鼻咽癌各个临床阶段之间血清肽表达模式无明显差异;9.鼻咽癌治疗前后血清肽表达模式有较小差异;10.EBV阳性和阴性鼻咽癌血清肽谱无明显差异;11.生存曲线分析提示3890Da血清肽与预后存在相关性;12.使用TLDA芯片获得了鼻咽癌患者和非癌人群血清miRNA表达谱,分别检测到103个和125个miRNA表达;13.对鼻咽癌患者和非癌人群血清miRNA表达谱进行比较分析和验证,发现miR-17、miR-20a、miR-486-3p在鼻咽癌血清中表达升高,miR-29c、miR-223在鼻咽癌血清中表达下降。14.建立了鼻咽癌血清miRNA诊断模型:A=(CtmiR-29c+CtmiR-223)-(CtmiR-17+CtmiR-20a)-3.30(即A-3.30诊断为鼻咽癌;A-3.30诊断为非癌),其灵敏度和特异性在96%以上。15.生存曲线分析提示血清miR-20a与预后存在相关性。 结论:1.血清肽受到除疾病之外的多种因素的影响,血清肽组研究必须制定并按照严格标准统一的实验流程进行;2.鼻咽癌患者与非癌人群的血清肽表达模式及血清(?)niRNA表达谱都存在一定差异;3.血清肽表达模式的改变是鼻咽癌的早期事件;4.鼻咽癌血清肽和血清miRNA诊断模型的可靠性显著高于血清EBV-VCA-IgA检测方法,可能应用于临床鼻咽癌血清学诊断,且可能成为评价鼻咽癌预后的参考指标。


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