非酒精性脂肪肝形成过程中肝脏蛋白质谱变化的研究

【摘要】：目的：非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是多种因素引起肝脏疾病的一种病理学改变。近年来引起高度重视的并不限于这一疾病的病理学表现,而是能量过剩。能量物质在肝内积聚,不仅是代谢综合症在肝内的特异表现,也是向非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatosis hepatitis, NASH)甚至肝硬化(liver cirrhosis)和肝癌发展的风险因素之一。随着代谢综合症(metabolic syndrome)的发病率逐年增高,非酒精性脂肪肝引起了人们的空前重视。除了社会进步,环境致病因素得以明确外,NAFLD发生的分子机制和发展规律仍不十分清楚。这给NAFLD的防治带来了一定的困难。为此,本研究用高脂物质饲以大鼠,形成以能量过剩→高物质在动物体内积聚→发展为代谢综合症和NAFLD模型。用二维电泳(two-dimensional gel electrophoresis)与质谱(mass spectrometry)联合分析方法检测NAFLD发展过程中不同阶段的蛋白质谱变化,试图找到一至两种功能蛋白质分子,用以指导NAFLD发生机制的深入研究。 方法：1.代谢综合症、NAFLD动物模型的建立：20只SD大鼠随机分组后分别予以普通和高脂饲料喂养,观察不同时间的体重、OGTT值、LEE指数、肝指数、体脂及血脂变化趋势,并观察不同时间肝脏的病理特征及电镜下亚细胞水平损伤特点。2.肝脏蛋白质组学分析：在上述动物实验基础上,匀浆抽提不同实验阶段大鼠肝脏总蛋白进行双向凝胶电泳,从蛋白质表达丰度角度寻找差异表达蛋白质；对差异表达蛋白质进行胰酶酶解后用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)做肽指纹图,结合蛋白质数据库搜索进行蛋白质鉴定,并分析各差异蛋白质在非酒精性脂肪肝形成过程中的作用。 结果：1.高脂饲料喂养组的SD大鼠的体重较普通组明显增高(P0.05)；高脂组的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCH)及肝指数均较普通组增高,差异有统计学意义(P0.05)；普通组大鼠糖耐量未见明显异常,而高脂组则有明显变化(P0.05)。2.病理学改变：高脂组SD大鼠肝细胞脂肪变性程度及炎性活动度较普通组明显(P0.05)；电镜扫描显示高脂组大鼠肝细胞亚细胞水平出现肝细胞膜绒毛萎缩、胆微管扩张及线粒体肿胀等损害,而普通组大鼠类似病变则不明显。3.在高脂饲料喂养大鼠的不同阶段中,肝内蛋白质组学的变化具有一定的规律性：a.肝内蛋白质点数越来越少,饲养至18周时肝内蛋白质点数减少20%以上。b.不同时间的蛋白质变化以等电点不同的蛋白质变化最明显,近中性的蛋白质点数显现减少的趋势,而偏酸性的蛋白质仅在18周时突然增多。c.有效地鉴定出4种酶蛋白质,分别为甲硫氨酸腺苷转移酶1(methionine adenosyltransferase I, alpha)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase, mu 2)、还原型辅酶Ⅰ脱氢酶(NADH dehydrogenase)和醛脱氢酶A1(aldehyde dehydrogenase family 9, subfamily A1)。其中前三种蛋白质表达量随着高脂饮食的时间逐渐减少而醛脱氨酶则逐渐增多。 结论：一、用高脂饲料喂养的SD大鼠可模拟代谢综合症患者NAFLD的肝脏病理学改变。表现为：1.形态学：a.体重逐渐增加至肥胖,体内脂肪及肝脂含量增加；b.肝细胞内脂微粒形成；c.亚细胞水平损害的特点：呈现肝细胞膜绒毛萎缩→胆管细胞内出现微管→肝细胞线粒体肿胀的损害发生顺序。2.生化学：表现糖耐量异常,血甘油三酯(TG)和总胆固醇(TCH)升高。二、肝内蛋白质组学的变化具有一定的规律性,随着喂以高脂饮食后出现如下变化：1.肝内蛋白质点数越来越少,饲养至18周时肝内蛋白质点数减少20%以上。2.不同时间的蛋白质变化以等电点不同的蛋白质变化最明显,近中性的蛋白质点数显现减少的趋势,而偏酸性的蛋白质仅在18周时突然增多。3.有效地鉴定出4种酶蛋白质,分别为甲硫氨酸腺苷转移酶1(methionine adenosyltransferase I, alpha)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase, mu 2)、还原型辅酶Ⅰ脱氢酶(NADH dehydrogenase)和醛脱氢酶A1 (aldehyde dehydrogenase family 9, subfamily A1)。其中前三种蛋白质表达量随着高脂饮食的时间逐渐减少而醛脱氨酶则逐渐增多。这一规律意味着随着肝内脂肪的聚集,其抗氧化能力逐渐减弱,清除内源醛基化产物的能力逐渐增加,物质代谢朝着合成代谢方向发展。