小鼠青光眼模型视网膜神经节细胞损伤与CD3ζ关系的实验研究
【摘要】:研究背景青光眼是世界上最主要的不可逆性致盲性眼病之一,引起周边视野的缺损直至中心视力消失。视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell, RGC)的凋亡是青光眼的最主要特征之一,但是RGC损伤的具体机制至今不明,如何减少青光眼RGC的损害是世界性难题,观察RGC丢失的速度、形态的变化对揭示青光眼的病程有重要的临床指导意义。传统的研究RGC损伤的方法无法活体动态监测RGC的变化,目前国际上共焦激光显微镜活体观察转基因小鼠带自发荧光的RGC变化是一种新的趋势,但是主要集中在观察RGC数量的变化,最近有研究表明活体观察猴和小鼠RGC树突的可能性,但是还没有研究涉及到病理状态下,对RGC形态变化的观察。眼内压(introcular pressure, IOP)升高是青光眼发病的主要原因之一,但不能解释青光眼发病的所有特征。近年来免疫系统参与青光眼发病的相关研究越来越受关注。我们之前的研究已表明CD3δ是影响RGC树突形态和功能的关键因子,CD3δ-/-小鼠的树突密度明显大于同龄野生型小鼠。ShRNA沉默CD3δ在RGC的表达会导致该细胞树突明显增加,CD3ζ影响了生理状态下RGC树突的形态和功能,病理状态下是否导致了RGC的损伤有待进一步研究。目的
建立青光眼动物模型,选择合适的模型活体观察RGC变化,构建mCherry CD3ζshRNA表达载体,研究CD3ζ与RGC损伤的关系,探讨RNAi技术在视神经保护中的运用效果。
方法
1三种青光眼模型的建立:1)视神经挫伤模型:用能自动闭合的镊子夹伤视神经。2) NMDA诱导的视网膜损伤模型:玻璃体腔内注射NMDA (40nmol)导致RGC凋亡3)慢性高眼压模型:前房内注射微珠(10x 106 microbeads/ml)堵塞前房角导致眼压升高。
2 RGC损伤的观察:用共焦激光显微镜活体动态观察Thy1-CFP小鼠带自发荧光的RGC的数量变化和和Thy1-YFP小鼠带自发荧光的RGC的形态变化。
3 mCherry CD3ζshRNA表达载体构建:mCherry CD3ζshRNA表达载体是由编码shRNA的引物序列插入BamHI和XhoI位点之间。
4视网膜组织中CD3ζ的mRNA及蛋白表达水平检测:RT-PCR和Western blot法检测视网膜组织中CD3ζ的mRNA及蛋白表达水平。
5 Brn3b阳性的RGC检测:将mCherry CD3ζshRNA注射入小鼠玻璃体腔后,建立青光眼模型,取出视网膜行全视网膜铺片,计数Brn3b阳性的RGC。
结果
1建立了三种青光眼模型:1)视神经损伤模型2) NMDA诱导的视网膜损伤模型3)慢性高眼压模型
2视神经挫伤模型RGC减少主要集中于术后一周,7天时RGC减少97.4%(P<0.001),NMDA诱导的RGC减少主要集中于术后一天,24小时RGC减少94.7%(P0.001),慢性高眼压导致的RGC减少持续缓慢,第4周RGC减少26.7%(P0.001)。
3用Thy1-CFP小鼠和Thy1-YFP小鼠建立慢性高眼压模型,活体观察结果显示,Thy1-CFP小鼠3周后RGC减少21%±4.8%(P0.001),6周后RGC减少30%±4.7%(P0.001), Thy1-YFP小鼠的RGC的树突丢失早于胞体消失。
4成功构建了mCherry-CD3ζshRNA的表达载体,CD3ζshRNA减少HEK293的70%的CD3ζ表达。
5三种青光眼模型视网膜组织中CD3ζ的mRNA表达上升(P0.05),CD3ζ蛋白质表达水平与正常视网膜相比没有明显变化。
6玻璃体腔注射mCherry CD3ζshRNA的三种青光眼模型中RGC的丢失没有明显减少(P0.05)。
结论
1视神经挫伤模型引起的RGC减少主要集中在术后一周,NMDA诱导的RGC减少主要集中于术后24小时,而前房内注射微珠堵塞房角诱发的高眼压模型的RGC减少是持续缓慢的,更加拟合临床青光眼的状态。
2可利用共焦激光显微镜活体观察已建立慢性高眼压模型的Thy1-CFP小鼠的RGC的数量减少和Thy1-YFP小鼠的RGC的树突丢失。
3视神经挫伤模型、NMDA诱导的视网膜损伤模型、慢性高眼压模型的视网膜组织中CD3ζ的mRNA水平表达上升,但CD3ζ的蛋白表达水平无明显变化,玻璃体腔注射mCherry CD3ζshRNA的的三种青光眼模型,RGC的损伤没有明显减少,提示CD3ζ能与RGC的损伤无关。
|
|
|
|
1 |
吕明,赖春宁,于鸣,郭宁,黎燕,沈倍奋;抗人CD3嵌合抗体基因的构建、表达及表达产物的初步功能研究[J];细胞与分子免疫学杂志;2005年01期 |
2 |
张素倩;唐文静;吴俊峰;戴荣欣;秦涛;白晓明;代继宏;丁媛;赵晓东;;1例CD3ε缺陷致重症联合免疫缺陷病的临床及免疫学特征分析[J];免疫学杂志;2016年05期 |
3 |
林春兰;陈少华;杨力建;周羽竝;陈思;李扬秋;;多发性骨髓瘤患者外周血CD3ε基因的表达特点[J];细胞与分子免疫学杂志;2010年02期 |
4 |
陈功,黄强,兰青,周丽英,楼美清,沈茜,王文仲,周晓平;抗CD3-抗胶质瘤双特异抗体与IL-2协同的细胞毒性作用研究[J];中华神经外科杂志;1998年03期 |
5 |
杨治华,刘向阳,田海梅,李洁,李以莞,沈德诚,佘鸣;抗人CD3人/鼠嵌合抗体的表达及特性[J];中国肿瘤生物治疗杂志;1995年02期 |
6 |
杨笑莹;李梦;赵威;唐敏;张志谦;;抗α2δ1/CD3双特异性抗体的制备和功能的初步研究[J];中国生物工程杂志;2020年07期 |
7 |
姜文国;刘荣;刘芳;王金宏;邵晓枫;舍鸣;朱慧芳;;基于4-1BBL和CD3双信号的融合蛋白协同抗肿瘤作用研究[J];生物技术通报;2010年10期 |
8 |
沈琦;陈少华;杨力建;李萡;闫小娟;李扬秋;;淋巴细胞白血病患者CD3基因表达模式的变化[J];暨南大学学报(自然科学与医学版);2011年02期 |
9 |
宣丽;徐丹;吴秀丽;凌奕文;范志平;张钰;刘启发;;G-CSF动员前后外周血T细胞CD3基因表达水平变化特点[J];细胞与分子免疫学杂志;2011年10期 |
10 |
杨介钻,张众,马骊,姚新生,周明乾,王祥斌,王小宁;抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体的生物学活性研究[J];癌症;2005年07期 |
11 |
傅耀文,周洪澜,王伟刚,王金国;抗CD3单克隆抗体在预防肾移植术后急性排斥反应中的作用[J];中国免疫学杂志;2004年12期 |
12 |
付建平;郭政;高谦;罗璋;聂品;;中华鳖CD3γ/δ、CD3ε和CD3ζ分子的克隆与表达分析[J];中国水产科学;2014年01期 |
13 |
朱子鹏;刘娜;李影;王辰;张璇;顾斌;;肿瘤坏死因子α刺激下人牙髓干细胞与CD3~+T细胞共培养后生物学功能的变化[J];解放军医学院学报;2021年04期 |
14 |
李敬果;翟晓翔;张翠侠;王建力;;皮肤鳞状细胞癌中生存素基因的表达与CD3~+T细胞的浸润[J];中国麻风皮肤病杂志;2008年06期 |
15 |
祁乐中;王小祥;顾民;张炜;徐正铨;;抗CD3单克隆抗体治疗肾移植术后耐激素性排斥反应[J];临床和实验医学杂志;2006年08期 |
16 |
裘宇容,杨春莉,王前,刘飞,郑小飞;2例异体手移植术后受者T细胞亚群与CD3~+HLA-DR~+细胞水平的动态观察[J];临床检验杂志;2001年03期 |
17 |
高美华;王娟;张蓓;王冰;解西河;;人CD3ζRNAi逆转录病毒载体的构建及鉴定[J];细胞与分子免疫学杂志;2012年01期 |
18 |
彭芳珍;胡艳欣;佘锐萍;;慢性热应激对猪肠道CD3~+T细胞表达的影响[J];皖西学院学报;2011年02期 |
19 |
朱慧芬,王晓林,张悦,沈关心,熊伟;抗CD3-抗B细胞白血病独特型双特异性抗体的制备及细胞毒性[J];细胞与分子免疫学杂志;1998年01期 |
|