小鼠青光眼模型视网膜神经节细胞损伤与CD3ζ关系的实验研究

【摘要】：研究背景青光眼是世界上最主要的不可逆性致盲性眼病之一,引起周边视野的缺损直至中心视力消失。视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell, RGC)的凋亡是青光眼的最主要特征之一,但是RGC损伤的具体机制至今不明,如何减少青光眼RGC的损害是世界性难题,观察RGC丢失的速度、形态的变化对揭示青光眼的病程有重要的临床指导意义。传统的研究RGC损伤的方法无法活体动态监测RGC的变化,目前国际上共焦激光显微镜活体观察转基因小鼠带自发荧光的RGC变化是一种新的趋势,但是主要集中在观察RGC数量的变化,最近有研究表明活体观察猴和小鼠RGC树突的可能性,但是还没有研究涉及到病理状态下,对RGC形态变化的观察。眼内压(introcular pressure, IOP)升高是青光眼发病的主要原因之一,但不能解释青光眼发病的所有特征。近年来免疫系统参与青光眼发病的相关研究越来越受关注。我们之前的研究已表明CD3δ是影响RGC树突形态和功能的关键因子,CD3δ-/-小鼠的树突密度明显大于同龄野生型小鼠。ShRNA沉默CD3δ在RGC的表达会导致该细胞树突明显增加,CD3ζ影响了生理状态下RGC树突的形态和功能,病理状态下是否导致了RGC的损伤有待进一步研究。目的 建立青光眼动物模型,选择合适的模型活体观察RGC变化,构建mCherry CD3ζshRNA表达载体,研究CD3ζ与RGC损伤的关系,探讨RNAi技术在视神经保护中的运用效果。 方法 1三种青光眼模型的建立：1)视神经挫伤模型：用能自动闭合的镊子夹伤视神经。2) NMDA诱导的视网膜损伤模型：玻璃体腔内注射NMDA (40nmol)导致RGC凋亡3)慢性高眼压模型：前房内注射微珠(10x 106 microbeads/ml)堵塞前房角导致眼压升高。 2 RGC损伤的观察：用共焦激光显微镜活体动态观察Thy1-CFP小鼠带自发荧光的RGC的数量变化和和Thy1-YFP小鼠带自发荧光的RGC的形态变化。 3 mCherry CD3ζshRNA表达载体构建：mCherry CD3ζshRNA表达载体是由编码shRNA的引物序列插入BamHI和XhoI位点之间。 4视网膜组织中CD3ζ的mRNA及蛋白表达水平检测：RT-PCR和Western blot法检测视网膜组织中CD3ζ的mRNA及蛋白表达水平。 5 Brn3b阳性的RGC检测：将mCherry CD3ζshRNA注射入小鼠玻璃体腔后,建立青光眼模型,取出视网膜行全视网膜铺片,计数Brn3b阳性的RGC。 结果 1建立了三种青光眼模型：1)视神经损伤模型2) NMDA诱导的视网膜损伤模型3)慢性高眼压模型 2视神经挫伤模型RGC减少主要集中于术后一周,7天时RGC减少97.4%(P＜0.001),NMDA诱导的RGC减少主要集中于术后一天,24小时RGC减少94.7%(P0.001),慢性高眼压导致的RGC减少持续缓慢,第4周RGC减少26.7%(P0.001)。 3用Thy1-CFP小鼠和Thy1-YFP小鼠建立慢性高眼压模型,活体观察结果显示,Thy1-CFP小鼠3周后RGC减少21%±4.8%(P0.001),6周后RGC减少30%±4.7%(P0.001), Thy1-YFP小鼠的RGC的树突丢失早于胞体消失。 4成功构建了mCherry-CD3ζshRNA的表达载体,CD3ζshRNA减少HEK293的70%的CD3ζ表达。 5三种青光眼模型视网膜组织中CD3ζ的mRNA表达上升(P0.05),CD3ζ蛋白质表达水平与正常视网膜相比没有明显变化。 6玻璃体腔注射mCherry CD3ζshRNA的三种青光眼模型中RGC的丢失没有明显减少(P0.05)。 结论 1视神经挫伤模型引起的RGC减少主要集中在术后一周,NMDA诱导的RGC减少主要集中于术后24小时,而前房内注射微珠堵塞房角诱发的高眼压模型的RGC减少是持续缓慢的,更加拟合临床青光眼的状态。 2可利用共焦激光显微镜活体观察已建立慢性高眼压模型的Thy1-CFP小鼠的RGC的数量减少和Thy1-YFP小鼠的RGC的树突丢失。 3视神经挫伤模型、NMDA诱导的视网膜损伤模型、慢性高眼压模型的视网膜组织中CD3ζ的mRNA水平表达上升,但CD3ζ的蛋白表达水平无明显变化,玻璃体腔注射mCherry CD3ζshRNA的的三种青光眼模型,RGC的损伤没有明显减少,提示CD3ζ能与RGC的损伤无关。