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人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠梗阻性肾间质纤维化的实验研究

黄丹琳  
【摘要】:目的分离、培养和鉴定人UC-MSCs,观察异种UC-MSCs静脉移植的安全性及UC-MSCs在UUO大鼠体内的分布,探讨人UC-MSCs移植治疗梗阻性肾间质纤维化的可行性,分析UC-MSCs移植抗纤维化的可能机制,为临床UC-MSCs移植治疗慢性肾脏疾病提供理论和实验依据。 方法 1.无菌条件下取新鲜脐带,采用联合酶序贯消化法分离UC-MSCs,并通过传代进行纯化和扩增培养,观察细胞的形态特点,绘制生长曲线;进行细胞冻存和复苏,观察细胞的稳定性;用流式细胞仪检测UC-MSCs表面抗原;诱导向成骨、脂肪细胞分化以观察其多项分化潜能。冻存的UC-MSC复苏、扩增,调整细胞浓度为5×106/ml备用。 2.8周龄雌性SD大鼠84只随机分为4组,各21只:①单侧输尿管梗阻组(UUO组):。大鼠行左侧输尿管结扎术,术后7d尾静脉注射PBS1ml。②单侧输尿管梗阻+细胞移植组(UUO+MSCs组):大鼠行左侧输尿管结扎术,术后7d尾静脉注射5×10~6UC-MSCs。③假手术组(Sham组):手术入路方式同UUO组,进腹腔后分离左输尿管但不结扎输尿管,术后7d经尾静脉注射PBS1ml。④假手术+细胞移植组(Sham+MSCs组):手术入路方式同UUO组,进腹腔后分离左输尿管但不结扎输尿管,术后7d尾静脉注射5×106UC-MSCs。四组大鼠分别于造模后14d、21d、28d共3个时间点各取7只杀鼠,造模后和杀鼠前均测量体重,杀鼠后收集血标本、肾脏、心脏、肝脏、脾脏和肺,行以下检查:①血标本检测血常规、血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶;②四组大鼠肾组织均行苏木精-伊红(HE)、过碘酸希夫反应(PAS)和Masson染色,光学显微镜下观察肾组织的形态学改变;③免疫组化染色检测四组大鼠心、肝、脾、肺、肾组织MAB1281(标记人UC-MSCs)阳性表达细胞,光镜下观察并计数阳性细胞个数。 3.8周龄雌性SD大鼠63只随机分为UUO组、UUO+MSCs组和Sham组,每组各21只,模型的制备和细胞移植的剂量同前。三组大鼠分别于造模后14d、21d、28d共3个时间点各取7只杀鼠,杀鼠后收集24小时尿液、血标本和肾脏,行以下检查:①尿标本行24h尿蛋白含量检测,血标本检测血清尿素氮和肌酐水平;②三组大鼠肾组织光学显微镜下观察肾组织的形态学改变,并对肾小管间质损害进行评分;③免疫组化染色检测三组大鼠肾组织α-SMA、Fn、TGF-β1和BMP-7的表达,光镜下观察阳性反应,测量黄色部分的累积光密度并计算平均光密度。④Western blot进一步检测肾组织a-SMA、Fn、TGF-β1和BMP-7的蛋白定量,测量阳性条带的光密度值并计算与β-tubulin的光密度比值。 结果 1.经酶消化后的原代细胞多于24-48小时内贴壁,1周以后增长速度较快,呈平行排列生长或旋涡状生长,于第2、3周可形成大于80%融合贴壁细胞层;冻存后复苏的P4代细胞,生长速度较快,倍增时间均约为28h,细胞形态无明显改变;P2代脐带来源贴壁细胞成骨定向诱导14天,可见细胞间布满黑色颗粒,提示有矿化基质沉积,成脂肪定向诱导14天后,可见油红-O染色呈强阳性;流式细胞仪细胞免疫表型检测发现脐带源贴壁细胞表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等MSCs标记物,不表达造血细胞标记CD34、CD45,不表达内皮细胞标记CD31和HLA-DR。 2.各时间点Sham+MSCs组的体重增长、血常规、谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平与Sham组比较差异没有显著性意义(P0.05)。②UUO组和UUO+MSCs组结扎侧肾脏随时间的延长,间质纤维化程度逐步加重,肾小球无明显病变。③四组大鼠心、肝、脾、肺大体标本肉眼观察均无明显异常。Sham+MSCs组心、肝、脾、肺、肾组织光镜下未见明显炎性细胞浸润。④外源性的UC-MSCs主要分布在肺和脾脏,其次是肾脏和心肌,肝脏几乎没有。UUO+MSCs组脾脏的UC-MSCs明显少于Sham+MSCs组(P0.01),但肾脏的UC-MSCs却多于Sham+MSCs组,而且UUO+MSCs组的左肾UC-MSCs主要分布在肾间质,Sham+MSCs组的肾脏UC-MSCs却主要分布在肾小球。 3.①各时间点三组间24h尿蛋白排出量无显著性差异(P0.05)。术后第14天,UUO+MSCs组与UUO组相比,血肌酐值下降,差异有显著性意义(P0.05)。②术后14天和21天,UUO+MSCs组大鼠肾小管间质的病理积分、肾组织Fn和α-SMA免疫组化平均光密度和蛋白表达均低于UUO组(P0.05),但术后28天两组间无明显差异(P0.05)。③术后第14天和28天,与UUO组相比,UUO+MSCs组肾组织TGF-β1免疫组化平均光密度和蛋白表达均减少,但BMP-7平均光密度和蛋白表达增多(P0.05)。④肾组织中α-SMA的表达与TGF-β1的表达呈正相关,而与BMP-7的表达呈负相关。 结论 1.联合酶序贯消化法能成功分离人UC-MSCs,经传代、冻存复苏后的细胞特性无明显改变。培养的细胞具有MSCs的基本特性,可用于后续的MSCs移植的研究。 2.异种UC-MSCs静脉移植是安全可行的;异种UC-MSCs静脉移植到梗阻性肾间质纤维化大鼠后能归巢到受损的肾组织。 3. UC-MSCs移植对改善UUO大鼠的肾功能和肾间质纤维化有促进作用;UC-MSCs治疗梗阻性肾纤维化的机制以及细胞移植的剂量和时机还有待进一步研究。


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