去甲斑蝥素对糖尿病肾病肾小管间质纤维化的作用及机制研究

【摘要】：糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)已成为终末期肾功能衰竭的重要原因之。DN早期可出现肾小管间质纤维化,且不依赖肾小球病变直接促进肾功能水平下降。阻止DN肾小管间质纤维化已成为当前的研究热点。然而目前尚没有理想的逆转DN肾小管间质纤维化的药物。 去甲斑蝥素(Norcantharidin NCTD)是人工合成的斑蝥素衍生物。本研究所两位博士研究生前期研究发现：NCTD能减轻蛋白负荷大鼠和梗阻性肾肾病大鼠的肾间质纤维化程度；体外实验证实NCTD能抑制白蛋白刺激的肾小管上皮细胞NF-κB和CTGF的表达；阻止TGF-β1介导的肾小管上皮细胞转分化。我们推测NCTD是一种极有前景的抗肾间质纤维化药物。但NCTD对DN肾小管间质纤维化的作用如何尚不清楚。 钙调蛋白磷酸酶(Calcineurin CaN)在肾组织尤其肾小管上皮细胞上表达,研究证实CaN在促进DN肾小球硬化过程中起重要作用,但尚无其在DN肾间质纤维化过程中的研究。据报道NCTD是CaN的抑制剂,NCTD是否通过抑制DN肾小管上皮细胞CaN信号通路,发挥抗DN肾间质纤维化的作用亟待深入研究。 目的：本课题拟通过DN动物模型和高糖刺激的肾小管上皮细胞模型,从三个方面进行研究：1.观察NCTD对2型糖尿病肾病大鼠肾小管间质纤维化的影响；2.观察NCTD对高糖刺激的HK-2细胞细胞外基质和TGF-β1表达的影响；3。研究NCTD对糖尿病肾病肾小管上皮细胞CaN表达的影响,探讨NCTD抗DN肾间质纤维化与其抑制CaN的关系。通过本研究不但可扩大NCTD的适应症,而且为将其开发成为治疗DN,延缓肾功能进展的有效药物提供理论依据。 方法：1.建立2型DN大鼠模型：SD大鼠随机分为正常对照组、模型组和NCTD治疗组。采用高糖高脂饲料喂养联合低剂量STZ注射诱发SD大鼠2型糖尿病肾病模型(STZ溶于0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液中,pH值4.5),对照组只注射相同体积的枸橼酸盐缓冲液,72h后测定血糖和尿糖,血糖值≥16.7mmol/L,尿糖值+++～++++者确定为DM模型。成模后,NCTD治疗组予以腹腔注射去甲斑蝥素(0.05mg/kg/d和0.1mg/kg/d)。分别于第3、8周末处死大鼠,取部分肾皮质组织置于4%多聚甲醛固定,观察各组之间肾脏病理学变化。采用免疫组化方法检测FN, ColⅣ, TGF-β1和CaN分布以及表达情况。 2.常规培养HK-2细胞,无血清DMEM培养基同步培养24h,细胞分组：(1)正常糖组(NG, D-Glucose 5.5mmol/L),(2)甘露醇对照组(NG+M, D-Glucose5.5 mmol/L+mannitol 24.5 mmol/L), (3)高糖组1(HG, D-Glucose 30 mmol/L), (4)高糖+NCTD(D-Glucose 30 mmol/L+NCTD2.5,5,mg/L)。台盼蓝排斥实验检测NCDT对高糖刺激的细胞毒性。MTT法检测NCTD对高糖刺激的细胞增殖的影响。收集培养6、24、48h后细胞总RNA及蛋白,用实时定量PCR检测细胞FN、ColⅣ, TGF-pl和CaN mRNA水平的表达,采用间接细胞免疫荧光法检测CaN下游NFATc在细胞分布,采用Western blot检测FN、ColⅣ、TGF-β, CaN和NFATc蛋白蛋白水平的表达。 3.常规培养HK-2细胞,转染CaN siRNA,细胞分5组：(1)正常糖组(NG, D-Glucose 5.5mmol/L),(2)高糖组(HG, D-Glucose 30 mmol/L),(3)高糖+CaNsiRNA组,用lipofectamine 2000转染试剂将带绿色荧光的CaN siRNA转染到细胞内,24h后培养于30mM D-葡萄糖的DMEM中,(4)高糖+CaN siRNA+NCTD组。细胞转染CaN-SiRNA 24h后,用5ug/ml NCTD预处理15min后培养于30mMD-葡萄糖的DMEM中,(5)高糖+NCTD组：用5ug/ml NCTD预处理15min后再用30mMD-葡萄糖的DMEM培养中。转染后在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光,检测转染效率。采用Western-blot及实时定量PCR检测CaN蛋白及RNA表达水平,明确CaN siRNA干扰效果。采用Western blot比较NCTD对HK-2表达FN, ColIV及TGF-β1的影响与其抑制CaN的关系。 结果：1.成功构建DN模型：72h测定血糖和尿糖,血糖值16.7mmol/L,尿糖值+++～+++,确定为糖尿病模型。8周末时,糖尿病大鼠的血糖显著高于正常对照组,且出现了明显的“三多一少”症状,检测尿白蛋白明显增高,Masson染色肾小管间质出现明显的胶原沉积,说明DN大鼠模型建立是成功的。NCTD组与模型组比较,能减小肾小管间质胶原相对面积(P0.05),下调肾小管区胶原Ⅳ,FN的表达,以及TGF-β1蛋白的表达(P0.05)。 2.正常大鼠肾小管有少量CaN蛋白表达,8周末糖尿病肾组织CaN蛋白表达增加,NCTD以剂量依赖方式抑制Cano的表达(P0.05)。 3.台盼蓝实验结果提示,不同浓度NCTD作用72小时后,浓度超过5mg/L的NCDT对高糖环境下的HK-2细胞有明显的毒性。MTT实验结果提示,NCTD2.5mg/L和l5mg/L干预组能抑制HG诱导的HK-2细胞的增殖(P0.05)5mg/LNCTD的抑制作用更强些。所以,体外实验选择NCTD 2.5mg/L和5mg/L两个浓度组。 4.实时定量PCR和1Western blot结果显示：30mM D-葡萄糖可引起HK-2细胞表达FN, ColⅣ和TGF-β1 mRNA以及蛋白水平的升高(P0.05),而NCTD可抑制高糖刺激的FN, ColⅣ和TGF-β1的表达(P0.05)。30mM D-甘露醇对上述指标均无影响(P0.05) 5.实时定量PCR和Western blot:结果显示：30mMD-葡萄糖可导致HK-2细胞表达CaN mRNA以及蛋白水平的升高,而NCTD在基因以及蛋白水平均可抑制CaN的表达(p0.05)。免疫荧光发现,CaN下游NFATc在正常对照组中存在于胞浆,高糖刺激后细胞核内开始表达,高糖刺激30min后发生明显的核转位,去甲斑蝥素能在一定程度上抑制核转位的发生,减少高糖刺激后核内NFATc的表达。 6.转染CaN-SiRNA后,高糖刺激后HK-2细胞中CaN mRNA以及蛋白表达均减少,而FN, ColⅣ以及TGF-β1蛋白水平表达都明显增强(P0.05)。相比于CaN-SiRNA组,NCTD可抑制高糖刺激的FN, ColⅣ和TGF-β1的表达。 结论：1.NCTD能下调HK-2细胞FN, Col IV及TGF-β1的表达,减轻DN早期肾间质纤维化。 2.NCTD能下调DN肾小管上皮细胞CaN的表达,阻断CaN/NFATc信号通路； 3.NCTD抗DN肾小管间质纤维化的作用与其阻断CaN/NFATc信号通路无关。